Aplicação de microdisseção a laser para descobrir transcrição regional em tecido renal humano
Summary
Descrevemos um protocolo para microdisseção a laser de subsegmentos do rim humano, incluindo o glomerulus, túbulo proximal, membro ascendente espesso, coletor de duto e interstício. O RNA é então isolado dos compartimentos obtidos e o sequenciamento de RNA é realizado para determinar alterações na assinatura transcriômica dentro de cada subsegmento.
Abstract
A análise da expressão genética do tecido renal humano é uma ferramenta importante para entender a homeostase e a fisiopatologia da doença. Aumentar a resolução e a profundidade dessa tecnologia e estendê-la ao nível das células dentro do tecido é necessário. Embora o uso de sequenciamento de RNA uni nuclear e unicelular tenha se espalhado, as assinaturas de expressão das células obtidas a partir da dissociação tecidual não mantêm o contexto espacial. A microdisseção a laser (LMD) baseada em marcadores fluorescentes específicos permitiria o isolamento de estruturas específicas e grupos celulares de interesse com localização conhecida, permitindo assim a aquisição de assinaturas transcriômicas ancoradas espacialmente no tecido renal. Otimizamos uma metodologia de LMD, guiada por uma mancha rápida baseada em fluorescência, para isolar cinco compartimentos distintos dentro do rim humano e realizar sequenciamento subsequente de RNA de valiosos espécimes de tecido renal humano. Também apresentamos parâmetros de controle de qualidade para permitir a avaliação da adequação das amostras coletadas. O fluxo de trabalho descrito neste manuscrito mostra a viabilidade dessa abordagem para isolar assinaturas transcriômicas subsu segmentares com alta confiança. A abordagem metodológica aqui apresentada também pode ser aplicada a outros tipos de tecidos com substituição de marcadores de anticorpos relevantes.
Introduction
Os avanços tecnológicos no estudo dos espécimes teciduais melhoraram a compreensão do estado de saúde e da doença em diversos órgãos. Tais avanços têm sublinhado que a patologia pode começar em regiões limitadas ou em tipos celulares específicos, mas têm implicações importantes em todo o órgão. Portanto, na atual era da medicina personalizada, é importante compreender a biologia tanto no nível celular quanto regional e não apenas globalmente1. Isso é particularmente verdadeiro no rim, que é composto por várias células e estruturas especializadas que iniciam diferencialmente e/ou respondem ao estresse patológico. A patogênese de vários tipos de doença renal humana ainda não é bem compreendida. Gerar uma metodologia para estudar mudanças na expressão genética em segmentos tubulares específicos, estruturas ou áreas do interstício no rim humano aumentará a capacidade de descobrir alterações específicas da região que poderiam informar sobre a patogênese da doença.
Biópsia de rim humano é um recurso limitado e precioso. Portanto, as tecnologias que interrogam a transcrição no tecido renal devem ser otimizadas para economizar tecido. Os métodos disponíveis para estudar transcrição em nível celular e regional incluem sequenciamento de RNA de célula única (scRNaseq), RNaseq nuclear único (snRNaseq), hibridização espacial in situ e microdissecção a laser (LMD). Este último é adequado para o isolamento preciso de regiões ou estruturas de interesse dentro de seções teciduais, para sequenciamento e análise de RNA a jusante2,3,4,5. A LMD pode ser adotada para contar com a identificação de tipos ou estruturas celulares específicas baseadas em marcadores validados usando imagens baseadas em fluorescência durante a dissecção.
As características únicas da microdisseção a laser assistida transcrição regional incluem: 1) a preservação do contexto espacial das células e estruturas, que complementa tecnologias celulares únicas onde as células são identificadas pela expressão e não histologicamente; 2) a tecnologia informa e é informada por outras tecnologias de imagem porque um marcador de anticorpos define assinaturas de expressão; 3) a capacidade de identificar estruturas mesmo quando os marcadores mudam na doença; 4) detecção de transcrições humildemente expressas em aproximadamente 20.000 genes; e 5) notável economia tecidual. A tecnologia é escalável para uma biópsia renal com menos de 100 μm de espessura de um núcleo necessário para aquisição suficiente de RNA e permite o uso de tecido congelado arquivado, que são comumente disponíveis em grandes repositórios ou centros acadêmicos6.
No trabalho seguinte, descrevemos em detalhes a tecnologia de transcrição regional e em massa, otimizada com um novo protocolo de coloração rápida de fluorescência para uso com tecido renal humano. Essa abordagem melhora em explorações clássicas de LMD porque fornece dados de expressão separados para os subsegmentos interstitium e nefron em oposição à expressão tubulointerstícia agregada. Incluem-se as medidas de garantia e controle de qualidade implementadas para garantir rigor e reprodutibilidade. O protocolo permite a visualização de células e regiões de interesse, resultando na aquisição satisfatória de RNA dessas áreas isoladas para permitir o sequenciamento de RNA a jusante.
Protocol
Representative Results
Discussion
A transcriptômica baseada em LMD é uma tecnologia útil que ancora a expressão genética em áreas específicas dentro do tecido. A base dessa tecnologia e sua potencial aplicação no rim foram descritas anteriormente8. No entanto, a otimização, modernização e simplificação da dissecção baseada em fluorescência especificamente destinada à dissecção de alta precisão para sequenciamento de RNA a jusante é menos onipresente. Como essa metodologia é espacialmente fundamentada dentro…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Geral: Os autores gostariam de agradecer aos pesquisadores do Projeto de Medicina de Precisão Renal (www.kpmp.org) pelo apoio e aconselhamento graciosos.
Financiamento: O suporte para este trabalho foi fornecido pelo NIH/NIDDK K08DK107864 (M.T.E.); NIH/NIDDK UG3DK114923 (T.M.E., P.C.D.); R01DK099345 (T.A.S.). A pesquisa relatada neste manuscrito foi apoiada pelo Projeto de Medicina de Precisão Renal (KPMP) do Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais (NIDDK), (www.kpmp.org), sob o número de premiação U2CDK114886.
Disponibilidade de dados e materiais: Os dados são arquivados no Omnibus de Expressão Genética (GEO # pendente)
Materials
| Acetone | Sigma-Aldrich | 270725-1L | |
| AMPure Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | |
| BSA | VWR | 0332-100G | |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| Desiccant Cartridge | Bel-Art | F42046-0000 | |
| DNAse | Qiagen | 79254 | RDD buffer is included in the pakage |
| Laser Microdissection Microscope | Leica | LMD6500 | |
| Megalin/LRP2 Antibody | Abcam | ab76969 | Directly conjugated to Alexa Fluor 568 |
| Microcentrifuge tubes | ThermoFisher | AB-0350 | |
| Microscope camera | Leica | DFC700T | |
| PBS (RNAse Free) | VWR | K812-500ML | |
| Phalloidin (Oregon Green 488) | ThermoFisher | O7466 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT0204 | |
| PPS-membrane slides | Leica | 11505268 | |
| qPCR Human Reference Total RNA 25 µg | Takara Clontech | 636690 | |
| RNA 6000 Eukaryote Total RNA Pico Chip | Agilent | 5067-1513 | |
| RNAse Away | ThermoFisher | 7000 | |
| RNAse Inhibitor | ThermoFisher | AM2696 | |
| Sequencer (HiSeq or NovaSeq) | Illumina | NA | |
| SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2 | Takara Clontech | 634411 | |
| Tamm-Horsfall Protein Antibody | R&D Systems | AF5144 | Directly conjugated to Alexa Fluor 546 |
| Tissue-Tek® O.C.T. Compound | Sakura | 4583 |
Referencias
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- Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication. Kidney International. 58 (3), 1346-1353 (2000).
- Woroniecki, R. P., Bottinger, E. P. Laser capture microdissection of kidney tissue. Methods in Molecular Biology. 466, 73-82 (2009).
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