Application de la microdissection laser pour découvrir la transcriptomics régionale dans le tissu rénal humain
Summary
Nous décrivons un protocole pour la microdissection laser des sous-segments du rein humain, y compris le glomerulus, le tubule proximal, le membre ascendant épais, le conduit de collecte et l’interstitium. L’ARN est ensuite isolé des compartiments obtenus et le séquençage de l’ARN est effectué pour déterminer les changements dans la signature transcriptomique dans chaque sous-segment.
Abstract
L’analyse de l’expression génétique du tissu rénal humain est un outil important pour comprendre l’homéostasie et la pathophysiologie des maladies. Il est nécessaire d’augmenter la résolution et la profondeur de cette technologie et de l’étendre au niveau des cellules dans le tissu. Bien que l’utilisation du séquençage d’ARN nucléaire et unicelliste unique soit devenue répandue, les signatures d’expression des cellules obtenues de la dissociation tissulaire ne maintiennent pas le contexte spatial. La microdissection laser (LMD) basée sur des marqueurs fluorescents spécifiques permettrait l’isolement de structures spécifiques et de groupes cellulaires d’intérêt avec localisation connue, permettant ainsi l’acquisition de signatures transcriptomiques ancrées spatialement dans le tissu rénal. Nous avons optimisé une méthodologie de LMD, guidée par une tache basée sur la fluorescence rapide, pour isoler cinq compartiments distincts dans le rein humain et mener le séquençage ultérieur d’ARN des spécimens humains précieux de tissu de rein. Nous présentons également des paramètres de contrôle de la qualité pour permettre l’évaluation de l’adéquation des spécimens recueillis. Le flux de travail décrit dans ce manuscrit montre la faisabilité de cette approche pour isoler les signatures transcriptomiques sous-segmentales avec une grande confiance. L’approche méthodologique présentée ici peut également être appliquée à d’autres types de tissus avec substitution de marqueurs anticorps pertinents.
Introduction
Les progrès technologiques dans l’étude des échantillons de tissus ont amélioré la compréhension de l’état de santé et de la maladie dans divers organes. Ces progrès ont souligné que la pathologie peut commencer dans des régions limitées ou dans des types de cellules spécifiques, mais ont des implications importantes sur l’ensemble de l’organe. Par conséquent, à l’ère actuelle de la médecine personnalisée, il est important de comprendre la biologie à la fois au niveau cellulaire et régional et pas seulement globalement1. Cela est particulièrement vrai dans le rein, qui est composé de diverses cellules et structures spécialisées qui initient et/ou répondent différemment au stress pathologique. La pathogénie de divers types de maladie rénale humaine n’est toujours pas bien comprise. La génération d’une méthodologie pour étudier les changements dans l’expression des gènes dans des segments tubulaires spécifiques, des structures ou des zones de l’interstitium dans le rein humain améliorera la capacité de découvrir des changements spécifiques à la région qui pourraient éclairer sur la pathogénie de la maladie.
Les spécimens humains de biopsie rénale sont une ressource limitée et précieuse. Par conséquent, les technologies interrogeant la transcriptomique dans le tissu rénal devraient être optimisées pour économiser les tissus. Les méthodes disponibles pour étudier la transcriptomique au niveau cellulaire et régional comprennent le séquençage de l’ARN à cellule unique (scRNaseq), le RNaseq nucléaire unique (snRNaseq), l’hybridation spatiale in situ et la microdissection laser (LMD). Ce dernier est bien adapté à l’isolement précis des régions ou des structures d’intérêt dans les sections tissulaires, pour le séquençage et l’analyse del’ARN en aval 2,3,4,5. LMD peut être adopté pour s’appuyer sur l’identification de types ou de structures cellulaires spécifiques basés sur des marqueurs validés utilisant l’imagerie basée sur la fluorescence pendant la dissection.
Les caractéristiques uniques de la transcriptomics régionale assistée par microdissection laser comprennent : 1) la préservation du contexte spatial des cellules et des structures, qui complète les technologies cellulaires uniques où les cellules sont identifiées par expression plutôt qu’histologiquement; 2) la technologie informe et est informée par d’autres technologies d’imagerie parce qu’un marqueur d’anticorps définit des signatures d’expression ; 3) la capacité d’identifier les structures même lorsque les marqueurs changent dans la maladie; 4) détection de transcriptions faiblement exprimées dans environ 20 000 gènes; et 5) économie remarquable des tissus. La technologie est évolutive à une biopsie rénale avec moins de 100 μm d’épaisseur d’un noyau nécessaire à l’acquisition suffisante d’ARN et permet l’utilisation de tissus congelés archivés, qui sont couramment disponibles dans les grands dépôts ou centres universitaires6.
Dans les travaux qui ont suivi, nous décrivons en détail la technologie de transcriptomics régionale et en vrac, optimisée avec un nouveau protocole rapide de coloration par fluorescence pour une utilisation avec le tissu rénal humain. Cette approche améliore les explorations classiques du LMD parce qu’elle fournit des données d’expression distinctes pour les sous-segments interstitium et néphron par opposition à l’expression tubulointerstitial globale. On y inclut les mesures d’assurance et de contrôle de la qualité mises en œuvre pour assurer la rigueur et la reproductibilité. Le protocole permet la visualisation des cellules et des régions d’intérêt, ce qui se traduit par l’acquisition satisfaisante de l’ARN de ces zones isolées pour permettre le séquençage de l’ARN en aval.
Protocol
Representative Results
Discussion
La transcriptomics basée sur le LMD est une technologie utile qui ancre l’expression des gènes dans des zones spécifiques du tissu. La base de cette technologie et son application potentielle dans le rein a été décrite précédemment8. Toutefois, l’optimisation, la modernisation et la rationalisation de la dissection basée sur la fluorescence visant spécifiquement à une dissection de haute précision pour le séquençage de l’ARN en aval sont moins omniprésentes. Parce que cette m?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Général: Les auteurs remercient les chercheurs du Kidney Precision Medicine Project (www.kpmp.org) pour leur soutien et leurs conseils gracieux.
Financement : Le soutien à ces travaux a été fourni par les NIH/NIDDK K08DK107864 (M.T.E.); NIH/NIDDK UG3DK114923 (T.M.E., P.C.D.); R01DK099345 (S.T.A.). Les recherches rapportées dans ce manuscrit ont été soutenues par le National Institute of Diabetes and Digestive and the Kidney Diseases (NIDDK) Kidney Precision Medicine Project (KPMP), (www.kpmp.org), sous le numéro de prix U2CDK114886.
Disponibilité des données et des matériaux : Les données sont archivées dans le Gene Expression Omnibus (GEO # en attente)
Materials
| Acetone | Sigma-Aldrich | 270725-1L | |
| AMPure Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | |
| BSA | VWR | 0332-100G | |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| Desiccant Cartridge | Bel-Art | F42046-0000 | |
| DNAse | Qiagen | 79254 | RDD buffer is included in the pakage |
| Laser Microdissection Microscope | Leica | LMD6500 | |
| Megalin/LRP2 Antibody | Abcam | ab76969 | Directly conjugated to Alexa Fluor 568 |
| Microcentrifuge tubes | ThermoFisher | AB-0350 | |
| Microscope camera | Leica | DFC700T | |
| PBS (RNAse Free) | VWR | K812-500ML | |
| Phalloidin (Oregon Green 488) | ThermoFisher | O7466 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT0204 | |
| PPS-membrane slides | Leica | 11505268 | |
| qPCR Human Reference Total RNA 25 µg | Takara Clontech | 636690 | |
| RNA 6000 Eukaryote Total RNA Pico Chip | Agilent | 5067-1513 | |
| RNAse Away | ThermoFisher | 7000 | |
| RNAse Inhibitor | ThermoFisher | AM2696 | |
| Sequencer (HiSeq or NovaSeq) | Illumina | NA | |
| SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2 | Takara Clontech | 634411 | |
| Tamm-Horsfall Protein Antibody | R&D Systems | AF5144 | Directly conjugated to Alexa Fluor 546 |
| Tissue-Tek® O.C.T. Compound | Sakura | 4583 |
Referencias
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