ヒト腎臓組織における局所転写論を明らかにするレーザー微小解剖の応用
Summary
糸球体、近頭尿細管、太い上昇肢、集結管およびインタースティジウムを含むヒト腎臓のサブセグメントのレーザーマイクロディシセクションのプロトコルについて述べている。次いで、RNAを得られたコンパートメントから単離し、RNAシーケンシングを行い、各サブセグメント内のトランスクリプトームシグネチャの変化を決定する。
Abstract
ヒト腎臓組織の遺伝子発現解析は、恒常性および疾患病態生理を理解する重要なツールである。この技術の解像度と深さを高め、組織内の細胞のレベルにそれを拡張することが必要です。単一核および単一細胞RNAシーケンシングの使用は広く普及しているが、組織解離から得られた細胞の発現シグネチャは空間的文脈を維持しない。特定の蛍光マーカーに基づくレーザーマイクロディション(LMD)は、既知の局在化を伴う特定の構造および対象細胞群の単離を可能にし、それによって腎臓組織における空間的に固定されたトランスクリプトーミックシグネチャの取得を可能にする。迅速な蛍光ベースの染色に導かれたLMD方法論を最適化し、ヒト腎臓内の5つの異なるコンパートメントを分離し、その後のRNAシーケンシングを貴重なヒト腎臓組織標本から行います。また、収集した検体の妥当性の評価を可能にする品質管理パラメータも提示します。この原稿で概説されているワークフローは、高い信頼を持ってサブセグメントの転写シグネチャを分離するこのアプローチの実現可能性を示しています。ここで提示される方法論的アプローチは、関連する抗体マーカーの置換を伴う他の組織タイプにも適用され得る。
Introduction
組織標本の研究における技術の進歩は、様々な臓器における健康と病気の状態の理解を改善しました。このような進歩は、病理学が限られた領域または特定の細胞タイプで始まることができるが、臓器全体に重要な意味を持つことを強調している。したがって、現在の個別化医療の時代において、細胞レベルと地域レベルの両方で生物学を理解することが重要であり、世界的に1.これは、病理学的ストレスを開始および/または応答する様々な特殊な細胞および構造で構成される腎臓において特に当てはまる。様々なタイプのヒト腎臓病の病因はまだよく分かっていない。ヒト腎臓における特定の管状のセグメント、構造、または間質の領域における遺伝子発現の変化を研究する方法論を生み出すと、疾患の病因を知らせることができる領域固有の変化を発見する能力が高まる。
ヒト腎臓生検検は限られた貴重な資源です。したがって、腎臓組織のトランスクリプトミクスを問い合わせた技術は、組織を減態するために最適化されるべきである。細胞および地域レベルでのトランスクリプトミクスを研究するために利用可能な方法は、単一細胞RNAシーケンシング(scRNaseq)、単一核RNaseq(snRNaseq)、その場空間ハイブリダイゼーション、およびレーザーマイクロダイスセクション(LMD)を含む。後者は、下流RNAシーケンシングおよび分析2、3、4、5のために、組織切片内の対象となる領域または構造を正確に分離するために適しています。LMDは、解剖中に蛍光ベースのイメージングを使用して検証されたマーカーに基づいて、特定の細胞タイプまたは構造の同定に頼るために採用することができる。
レーザー顕微鏡解剖支援地域転写術のユニークな特徴には、1)細胞および構造の空間的文脈の保全が含まれ、細胞が組織学的ではなく発現によって同定される単一細胞技術を補完する。抗体マーカーは発現シグネチャを定義するため、2)この技術は他のイメージング技術に情報を提供し、知らされる。3)マーカーが疾患で変化した場合でも構造を識別する能力;4)約20,000遺伝子における低発現転写物の検出。5)顕著な組織経済。この技術は、十分なRNA取得に必要なコアの厚さが100μm未満の腎臓生検に対してスケーラブルであり、大規模なリポジトリまたは学術センター6で一般的に利用可能なアーカイブされた凍結組織の使用を可能にする。
その後の研究では、ヒト腎臓組織で使用するための新しい急速蛍光染色プロトコルで最適化された、地域およびバルクトランスクリプトミクス技術を詳細に記述します。このアプローチは、凝集した管間質の表現とは対照的に、インタースティジウムおよびネフロンサブセグメントに対して別々の発現データを提供するため、従来の LMD 探索を改善します。厳格かつ再現性を確保するために実施される品質保証と管理対策が含まれています。このプロトコルは、細胞および関心のある領域の可視化を可能にし、これらの孤立した領域からのRNAの満足のいく獲得をもたらし、下流RNAシーケンシングを可能にする。
Protocol
Representative Results
Discussion
LMDベースのトランスクリプトミクスは、組織内の特定の領域に遺伝子発現を固定する有用な技術である。腎臓におけるこの技術とその潜在的な応用の基礎は、前に説明された8.しかしながら、最適化、近代化、蛍光法解解の合理化は、特に下流RNAシーケンシングのための高精度解離を目的とすることは、あまりユビキタスではない。この方法論は組織内に空間的に接地され?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
一般的な: 著者らは、腎臓精密医療プロジェクト(www.kpmp.org)の研究者の優雅な支援とアドバイスに感謝したいと考えています。
資金調達: この作業のサポートは、NIH/NIDDK K08DK107864(M.T.E.)によって提供されました。NIH/NIDDK UG3DK114923 (T.M E., P.C.D.);R01DK099345 (T.A.S.)。この原稿で報告された研究は、国立糖尿病・消化器病研究所と腎臓病研究所(NIDDK)腎臓精密医療プロジェクト(KPMP)(kpMP)(www.kpmp.org)によって、賞番号U2CDK114886の下で支援されました。
データと材料の可用性: データは遺伝子発現オムニバス(GEO #保留中)にアーカイブされます。
Materials
| Acetone | Sigma-Aldrich | 270725-1L | |
| AMPure Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | |
| BSA | VWR | 0332-100G | |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| Desiccant Cartridge | Bel-Art | F42046-0000 | |
| DNAse | Qiagen | 79254 | RDD buffer is included in the pakage |
| Laser Microdissection Microscope | Leica | LMD6500 | |
| Megalin/LRP2 Antibody | Abcam | ab76969 | Directly conjugated to Alexa Fluor 568 |
| Microcentrifuge tubes | ThermoFisher | AB-0350 | |
| Microscope camera | Leica | DFC700T | |
| PBS (RNAse Free) | VWR | K812-500ML | |
| Phalloidin (Oregon Green 488) | ThermoFisher | O7466 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT0204 | |
| PPS-membrane slides | Leica | 11505268 | |
| qPCR Human Reference Total RNA 25 µg | Takara Clontech | 636690 | |
| RNA 6000 Eukaryote Total RNA Pico Chip | Agilent | 5067-1513 | |
| RNAse Away | ThermoFisher | 7000 | |
| RNAse Inhibitor | ThermoFisher | AM2696 | |
| Sequencer (HiSeq or NovaSeq) | Illumina | NA | |
| SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2 | Takara Clontech | 634411 | |
| Tamm-Horsfall Protein Antibody | R&D Systems | AF5144 | Directly conjugated to Alexa Fluor 546 |
| Tissue-Tek® O.C.T. Compound | Sakura | 4583 |
Referencias
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