יישום של מיקרו-דיסקציה בלייזר לחשיפת תעתיקים אזוריים ברקמת הכליה האנושית
Summary
אנו מתארים פרוטוקול למיקרו-דיסקציה בלייזר של תת-מקטעים של הכליה האנושית, כולל הגלומרולוס, צינורית פרוקסימלית, איבר עולה עבה, צינור איסוף ואינטרסטיציום. לאחר מכן, ה- RNA מבודד מהתאים המתקבלים ורצף ה- RNA מתבצע כדי לקבוע שינויים בחתימה התמלולומית בתוך כל מקטע משנה.
Abstract
ניתוח ביטוי גנים של רקמת כליה אנושית הוא כלי חשוב להבנת הומאוסטזיס ופתופיזיולוגיה של מחלות. הגדלת הרזולוציה והעומק של טכנולוגיה זו והרחבתה לרמת התאים בתוך הרקמה יש צורך. למרות שהשימוש ברצף RNA גרעיני יחיד ותא יחיד הפך נפוץ, חתימות הביטוי של תאים המתקבלים מדיסוציאציה של רקמות אינן שומרות על הקשר מרחבי. מיקרו-דיסקציה בלייזר (LMD) המבוססת על סמנים פלואורסצנטיים ספציפיים תאפשר בידוד של מבנים ספציפיים וקבוצות תאים מעניינות עם לוקליזציה ידועה, ובכך תאפשר רכישה של חתימות תעתיקיות מעוגנות באופן מעוגן במים ברקמת הכליה. יש לנו אופטימיזציה מתודולוגיית LMD, מונחה על ידי כתם מבוסס פלואורסצנטיות מהירה, כדי לבודד חמישה תאים נפרדים בתוך הכליה האנושית ולבצע רצף RNA הבאים מדגימות רקמת כליה אנושית יקרות ערך. אנו מציגים גם פרמטרים לבקרת איכות כדי לאפשר הערכה של הלימות הדגימות שנאספו. זרימת העבודה המתוארת בכתב יד זה מראה את ההיתכנות של גישה זו לבודד חתימות תעתיק תת-מגזריות בביטחון רב. הגישה המתודולוגית המוצגת כאן עשויה לחול גם על סוגי רקמות אחרים עם החלפת סמני נוגדנים רלוונטיים.
Introduction
ההתקדמות הטכנולוגית בחקר דגימות רקמות שיפרה את ההבנה של מצב הבריאות והמחלות באיברים שונים. התקדמות כזו הדגישה כי פתולוגיה יכולה להתחיל באזורים מוגבלים או בסוגי תאים ספציפיים, אך יש לה השלכות חשובות על האיבר כולו. לכן, בעידן הנוכחי של רפואה מותאמת אישית, חשוב להבין את הביולוגיה הן ברמה התאית והן ברמה האזורית ולא רק בעולם1. הדבר נכון במיוחד בכליה, המורכבת מתאים ומבנים מיוחדים שונים היוזמים ו/או מגיבים באופן דיפרנציאלי ללחץ פתולוגי. הפתוגנזה של סוגים שונים של מחלת כליות אנושית עדיין לא מובנת היטב. יצירת מתודולוגיה לחקר שינויים בביטוי גנים במקטעים צינוריים ספציפיים, מבנים או אזורים של interstitium בכליה האנושית תשפר את היכולת לחשוף שינויים ספציפיים באזור שיכולים ליידע על הפתוגנזה של המחלה.
דגימות ביופסיה של כליות אנושיות הן משאב מוגבל ויקר. לכן, טכנולוגיות לחקור transcriptomics ברקמת הכליה צריך להיות אופטימיזציה כדי להציע רקמות. השיטות הזמינות לחקר תעתיקים ברמה התאית והאזורית כוללות ריצוף RNA של תא יחיד (scRNaseq), RNaseq גרעיני יחיד (snRNaseq), בהכלאה מרחבית במקום, ומיקרו-דיסקציה בלייזר (LMD). זה האחרון מתאים היטב לבידוד מדויק של אזורים או מבנים של עניין בתוך מקטעי רקמה, עבור רצף RNA במורד הזרם וניתוח2,3,4,5. ניתן לאמץ LMD כדי להסתמך על זיהוי של סוגי תאים או מבנים ספציפיים המבוססים על סמנים מאומתים באמצעות דימות מבוסס פלואורסצנטיות במהלך הניתוח.
התכונות הייחודיות של מיקרו-דיסקציה בלייזר בסיוע תעתיקים אזוריים כוללות: 1) שימור ההקשר המרחבי של תאים ומבנים, המשלים טכנולוגיות תא יחיד שבהן תאים מזוהים על ידי ביטוי ולא על ידי היסטולוגיה; 2) הטכנולוגיה מודיעה ומעודכנה על ידי טכנולוגיות הדמיה אחרות מכיוון שסמן נוגדנים מגדיר חתימות ביטוי; 3) היכולת לזהות מבנים גם כאשר סמנים משתנים במחלה; 4) איתור תעתיקים בעלי ביטוי נמוך בכ-20,000 גנים; ו-5) כלכלת רקמות יוצאת דופן. הטכנולוגיה מדרגית לביופסיה בכליות עם עובי של פחות מ -100 מיקרומטר של ליבה הדרושה לרכישת RNA מספקת ומאפשרת שימוש ברקמה קפואה בארכיון, הזמינים בדרך כלל במאגרים גדולים או במרכזים אקדמיים6.
בעבודה שלאחר מכן, אנו מתארים בפירוט את טכנולוגיית התמלולים האזורית והתפזורת, הממוטבת עם פרוטוקול מכתים פלואורסצנטי מהיר חדשני לשימוש עם רקמת כליות אנושית. גישה זו משפרת את חקר ה- LMD הקלאסי מכיוון שהיא מספקת נתוני ביטוי נפרדים עבור מקטעי המשנה interstitium ו- nephron לעומת ביטוי tubulointerstitial המצטבר. כלולים אמצעי אבטחת איכות ובקרה המיושמים כדי להבטיח הקפדה ושחזור. הפרוטוקול מאפשר הדמיה של תאים ואזורים מעניינים, וכתוצאה מכך רכישה משביעת רצון של RNA מאזורים מבודדים אלה כדי לאפשר רצף RNA במורד הזרם.
Protocol
Representative Results
Discussion
תעתיקים מבוססי LMD היא טכנולוגיה שימושית המעגנת ביטוי גנים לאזורים ספציפיים בתוך הרקמה. הבסיס של טכנולוגיה זו ואת היישום הפוטנציאלי שלה בכליה תוארה בעבר8. עם זאת, אופטימיזציה, מודרניזציה וייעול של ניתוח מבוסס פלואורסצנטיות שמטרתו במיוחד ניתוח דיוק גבוה עבור רצף RNA במורד הזרם ה…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
כללי: המחברים מבקשים להודות לחוקרי פרויקט הרפואה המדויקת בכליות (www.kpmp.org) על תמיכתם ואדיבותם וייעוץ.
מימון ומימון: תמיכה בעבודה זו ניתנה על ידי NIH / NIDDK K08DK107864 (M.T.E.); NIH/NIDDK UG3DK114923 (T.M.E., P.C.D.); R01DK099345 (T.A.S.). מחקר שדווח בכתב יד זה נתמך על ידי המכון הלאומי לסוכרת ועיכול ומחלות כליות (NIDDK) פרויקט רפואת דיוק כליות (KPMP), (www.kpmp.org), תחת מספר הפרס U2CDK114886.
זמינות נתונים וחומרים: הנתונים מאוחסנים בארכיון ב- Omnibus ביטוי גנים (GEO # ממתין)
Materials
| Acetone | Sigma-Aldrich | 270725-1L | |
| AMPure Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | |
| BSA | VWR | 0332-100G | |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| Desiccant Cartridge | Bel-Art | F42046-0000 | |
| DNAse | Qiagen | 79254 | RDD buffer is included in the pakage |
| Laser Microdissection Microscope | Leica | LMD6500 | |
| Megalin/LRP2 Antibody | Abcam | ab76969 | Directly conjugated to Alexa Fluor 568 |
| Microcentrifuge tubes | ThermoFisher | AB-0350 | |
| Microscope camera | Leica | DFC700T | |
| PBS (RNAse Free) | VWR | K812-500ML | |
| Phalloidin (Oregon Green 488) | ThermoFisher | O7466 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT0204 | |
| PPS-membrane slides | Leica | 11505268 | |
| qPCR Human Reference Total RNA 25 µg | Takara Clontech | 636690 | |
| RNA 6000 Eukaryote Total RNA Pico Chip | Agilent | 5067-1513 | |
| RNAse Away | ThermoFisher | 7000 | |
| RNAse Inhibitor | ThermoFisher | AM2696 | |
| Sequencer (HiSeq or NovaSeq) | Illumina | NA | |
| SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2 | Takara Clontech | 634411 | |
| Tamm-Horsfall Protein Antibody | R&D Systems | AF5144 | Directly conjugated to Alexa Fluor 546 |
| Tissue-Tek® O.C.T. Compound | Sakura | 4583 |
Referencias
- El-Serag, H. B., et al. Gene expression in Barrett’s esophagus: laser capture versus whole tissue. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).
- Kohda, Y., Murakami, H., Moe, O. W., Star, R. A. Analysis of segmental renal gene expression by laser capture microdissection. Kidney International. 57 (1), 321-331 (2000).
- Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication. Kidney International. 58 (3), 1346-1353 (2000).
- Woroniecki, R. P., Bottinger, E. P. Laser capture microdissection of kidney tissue. Methods in Molecular Biology. 466, 73-82 (2009).
- Noppert, S. J., Eder, S., Rudnicki, M. Laser-capture microdissection of renal tubule cells and linear amplification of RNA for microarray profiling and real-time PCR. Methods in Molecular Biology. 755, 257-266 (2011).
- Amini, P., et al. An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing. BMC Molecular Biology. 18 (1), 22 (2017).
- . Catalytic FFPE Nucleic Acid Isolation for best NGS Performance Available from: https://celldatasci.com/products/RNAstorm/RNAstorm_Technical_Note.pdf (2016)
- Micanovic, R., Khan, S., El-Achkar, T. M. Immunofluorescence laser micro-dissection of specific nephron segments in the mouse kidney allows targeted downstream proteomic analysis. Physiological Reports. 3 (2), (2015).
- Lake, B. B., et al. A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys. Nature Communications. 10 (1), 2832 (2019).
- Rodriguez-Canales, J., et al. Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications. Methods in Molecular Biology. 980, 61-120 (2013).
- Hipp, J. D., et al. Computer-Aided Laser Dissection: A Microdissection Workflow Leveraging Image Analysis Tools. Journal of Pathology Informatics. 9, 45 (2018).
