Un écran suppresseur pour la caractérisation des liens génétiques régulant la durée de vie chronologique dans Saccharomyces cerevisiae

Summary

Voici un protocole pour identifier les interactions génétiques grâce à un écran suppresseur de nombre de copie accru dans Saccharomyces cerevisiae. Cette méthode permet aux chercheurs d’identifier, cloner et tester les suppresseurs chez les mutants de levure de courte durée. Nous testons l’effet de l’augmentation du nombre de copie de SIR2 sur la durée de vie dans un mutant null autophagie.

Abstract

Le vieillissement est la détérioration dépendante du temps des processus biologiques normaux d’un organisme qui augmente la probabilité de décès. De nombreux facteurs génétiques contribuent à des altérations du processus normal de vieillissement. Ces facteurs se croisent de façon complexe, comme en témoigne la richesse des liens documentés identifiés et conservés chez de nombreux organismes. La plupart de ces études se concentrent sur la perte de fonction, mutants null qui permettent un dépistage rapide de nombreux gènes simultanément. Il ya beaucoup moins de travail qui se concentre sur la caractérisation du rôle que la surexpression d’un gène dans ce processus. Dans le présent travail, nous présentons une méthodologie simple pour identifier et cloner des gènes dans la levure en herbe, Saccharomyces cerevisiae, pour l’étude dans la suppression du phénotype chronologique de durée de vie de courte durée vu dans beaucoup de milieux génétiques. Ce protocole est conçu pour être accessible aux chercheurs d’horizons variés et à divers stades universitaires. Le gène SIR2, qui code pour un daitone deacetylase, a été sélectionné pour le clonage dans le vecteur pRS315, car il ya eu des rapports contradictoires sur son effet sur la durée de vie chronologique. SIR2 joue également un rôle dans l’autophagie, qui résulte lorsqu’il est perturbé par la suppression de plusieurs gènes, y compris le facteur de transcription ATG1. Comme preuve de principe, nous cloneons le gène SIR2 pour effectuer un écran suppresseur sur le phénotype raccourci de durée de vie caractéristique du mutant atg1Δ déficient d’autophagie et le comparons à un fond génétique autrement isogène, de type sauvage.

Introduction

Le vieillissement est la perte d’intégrité dépendante du temps dans une myriade de processus biologiques qui augmente finalement la probabilité de mort organisationnelle. Le vieillissement est presque inévitable pour toutes les espèces. Au niveau cellulaire, il existe plusieurs caractéristiques bien caractérisées qui sont associées au vieillissement, y compris: instabilité génomique, altérations épigénétiques, perte de protéostase, dysfonctionnement mitochondrial, détection des nutriments dérégulé, sénescence cellulaire, et attrition télomère^1,2. Dans les organismes unicellulaires, tels que les levures, cela conduit à une réduction du potentiel réplictif et de la durée de vie chronologique^3,4. Ces changements cellulaires se manifestent dans des organismes plus complexes, comme les humains, comme des pathologies qui comprennent les cancers, l’insuffisance cardiaque, la neurodégénérescence, le diabète et l’ostéoporose^5,6,7. Malgré les nombreuses complexités qui caractérisent le processus de vieillissement, il existe la conservation de ces caractéristiques moléculaires sous-jacentes à ce processus à travers des organismes très divergents^8,9,10. L’identification des altérations de ces voies pendant le vieillissement a conduit à la réalisation qu’ils peuvent être manipulés par des changements de mode de vie – restriction alimentaire est montré pour prolonger considérablement la durée de vie dans de nombreux organismes¹¹. Ces voies convergent et se croisent les unes avec les autres et de nombreuses autres voies, de manière complexe. L’élucidation et la caractérisation de ces interactions offrent un potentiel d’interventions thérapeutiques pour prolonger la durée de vie et la durée de vie^12,13,14.

La conservation des fondements moléculaires du vieillissement permet la dissection fonctionnelle des interactions génétiques sous-jacentes au processus par l’utilisation d’organismes modèles plus simples – y compris dans la levure en herbe, Saccharomyces cerevisiae^15,16. Il existe deux types établis de vieillissement modélisés par la levure en herbe: le vieillissement chronologique (la durée de vie chronologique, CLS) et le vieillissement réplictif (la durée de vie réplicative, RLS)¹⁷. Le vieillissement chronologique mesure le temps qu’une cellule peut survivre dans un état non divisant. Ceci est analogue au vieillissement qui est vu dans les cellules qui passent la majorité de leur vie dans G₀, tels que les neurones⁴. Alternativement, la durée de vie réplicative est le nombre de fois qu’une cellule peut diviser avant l’épuisement et est un modèle pour les types de cellules mitotically actives (par exemple, le nombre de cellules filles qu’une cellule peut avoir)¹⁸.

L’objectif global de cette méthode est de présenter un protocole qui permet la dissection fonctionnelle de la génétique du vieillissement en utilisant S. cerevisiae. Bien qu’il y ait eu beaucoup d’excellentes études réalisées par de nombreux chercheurs qui ont mené à notre compréhension actuelle, il reste de nombreuses occasions disponibles pour les chercheurs en herbe de contribuer au domaine du vieillissement dès le début de leur carrière universitaire. Nous présentons une méthodologie claire qui permettra aux chercheurs de faire progresser davantage le domaine du vieillissement. Ce protocole est conçu pour être accessible à tous les chercheurs, quel que soit le stade de leur carrière universitaire, en fournissant les outils nécessaires pour formuler et tester leurs propres hypothèses nouvelles. L’avantage de notre approche est qu’il s’agit d’une méthode rentable facilement accessible à tous les chercheurs, quel que soit leur établissement – et qu’elle ne nécessite pas d’équipement coûteux et spécialisé nécessaire à certains protocoles¹⁹. Il existe plusieurs façons différentes de concevoir ce type d’écran, l’approche décrite dans ce travail est particulièrement susceptible de dépistage mutants null de gènes non essentiels qui présentent une réduction sévère de la durée de vie chronologique par rapport à une souche isogène de type sauvage de levure.

Comme preuve de principe, nous cloner SIR2, une désacétylase de lysine rapportée comme présentant à la fois un CLS prolongé et raccourci lorsqu’il est surexprimé. Sir2 surexpression a été récemment trouvé pour augmenter CLS dans les levures de vinification; cependant, plusieurs groupes n’ont signalé aucun lien entre sir2 et l’extension CLS, laissant son rôle sous la rubrique^20,21,22. En raison de ces rapports contradictoires dans la littérature, nous avons choisi ce gène pour ajouter des recherches indépendantes pour aider à clarifier le rôle de SIR2 dans le vieillissement chronologique, le cas échéant. En outre, l’augmentation du nombre de copies d’un homologue SIR2 prolonge la durée de vie dans un système de modèle de ver nématode²³.

L’autophagie est un système de dégradation intracellulaire pour fournir des produits cytosoliques, tels que les protéines et les organites, au lysosome²⁴. L’autophagie est intimement liée à la longévité par son rôle dans la dégradation des protéines endommagées et des organites pour maintenir l’homéostasie cellulaire²⁵. L’induction de l’autophagie dépend de l’orchestration de l’expression de nombreux gènes, et la suppression du gène ATG1 entraîne un CLS anormalement court dans la levure en herbe²⁶. Codes ATG1 pour une protéine sérine/thréonine kinase qui est nécessaire pour la formation de vésicule dans l’autophagie et le cytoplasme-à-vacuole (l’équivalent lysosomal fongique) voie^27,28. Ici, nous présentons notre méthode pour un écran de numéro de copie accru, testant l’effet de l’augmentation de la copie SIR2 sur le CLS dans un type sauvage et un fond atg1-null. Cette méthode s’adresse particulièrement aux jeunes chercheurs et aux groupes de recherche des établissements principalement de premier cycle, dont bon nombre des collectivités sous-représentées dans les sciences et disposent de ressources limitées.

Protocol

1. Identifier les interactions génétiques potentielles pour le dépistage Identifier le ou les antécédents génétiques pour la caractérisation, qui se traduit par une durée de vie chronologique anormalement court (CLS) dans Saccharomyces cerevisiae à l’aide de la base de données sur le génome de Saccharomyces (sgd, https://www.yeastgenome.org29,30), qui compile des informations phénotypiques connues pour cet organisme….

Representative Results

Comme il existe des rapports contradictoires sur le rôle de SIR2 pendant le vieillissement, nous avons choisi ce gène pour l’étude comme un suppresseur potentiel de l’atg1Δ mutant raccourci cls phénotype26. Le rôle de SIR2 est quelque peu controversé, avec des rapports contradictoires sur son rôle dans l’extension de CLS, mais il a été clairement lié à l’augmentation cls dans au moins un fond de levure, avec un rôle à la fois dans l’autophagie et …

Discussion

Démêler la génétique du vieillissement est un défi difficile, avec de nombreuses possibilités d’étude plus approfondie qui peuvent potentiellement donner des informations significatives sur les interactions complexes qui existent. Il existe de nombreuses méthodes qui permettent la génération rapide de mutants de perte de fonction pour l’étude des souches nulles de levure^45,46. Cette méthode présente une approche simple pour identifier et cloner l…

Materials

Fungal/Bacterial DNA kit	Zymo Research	D6005
HindIIIHF enzyme	New England Biolabs	R3104S
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530S
Plasmid miniprep kit	Qiagen	12123
SacII enzyme	New England Biolabs	R0157S
Salmon sperm DNA	Thermofisher	AM9680
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202S