JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Traducción Automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genética

Супрессорный экран для характеристики генетических связей, регулирующих хронологическую продолжительность жизни в Saccharomyces cerevisiae

Published: September 17, 2020
doi:
10.3791/61506
, , , , , , , , ,
1Department of Biology,William Paterson University

Summary

Вот протокол для выявления генетических взаимодействий с помощью увеличенного экрана супрессора числа копий в Saccharomyces cerevisiae. Этот метод позволяет исследователям идентифицировать, клонировать и тестировать супрессоры в недолговечных дрожжевых мутантах. Мы тестируем влияние увеличения числа копий SIR2 на продолжительность жизни в аутофагии нулевой мутант.

Abstract

Старение – это время, зависящее от ухудшения нормальных биологических процессов организма, что повышает вероятность смерти. Многие генетические факторы способствуют изменениям в нормальном процессе старения. Эти факторы пересекаются сложными способами, о чем свидетельствует богатство документированных связей, выявленных и сохраненных во многих организмах. Большинство из этих исследований сосредоточены на потере функции, нулевые мутанты, которые позволяют для быстрого скрининга многих генов одновременно. Существует гораздо меньше работы, которая фокусируется на характеристике роль, что переэкспрессия гена в этом процессе. В настоящей работе, мы представляем простую методологию для выявления и клонирования генов в начинающих дрожжей, Saccharomyces cerevisiae, для изучения в подавлении недолго хронологического фенотипа жизни видели во многих генетических фонов. Этот протокол предназначен для работы с исследователями из самых разных слоев общества и на различных академических этапах. Ген SIR2, который кодирует диацетилазу гистона, был выбран для клонирования в векторе pRS315, так как были противоречивые сообщения о его влиянии на хронологический срок службы. SIR2 также играет роль в аутофагии, которая приводит к нарушению через удаление нескольких генов, в том числе транскрипционный фактор ATG1. В качестве доказательства принципа, мы клонировать ген SIR2 для выполнения супрессорного экрана на сокращенной продолжительности жизни фенотип характерный для аутофагии дефицит atg1 ‘ мутант и сравнить его с иным изогенным, дикий тип генетического фона.

Introduction

Старение зависит от времени потери целостности в бесчисленных биологических процессов, что в конечном итоге увеличивает вероятность смерти организма. Старение почти неизбежно для всех видов. На клеточном уровне есть несколько хорошо охарактеризованных признаков, которые связаны со старением, в том числе: геномная нестабильность, эпигенетические изменения, потеря протеостаза, митохондриальная дисфункция, дерегулированное зондирование питательных веществ, клеточное сенесценция и истощениетеломер 1,2. В одноклеточных организмах, таких как дрожжи, это приводит к снижению репликативного потенциала и хронологическогопериода жизни 3,,4. Эти клеточные изменения проявляются в более сложных организмов, как люди, как патологии, которые включают рак, сердечная недостаточность, нейродегенерация, диабет иостеопороз 5,6,7. Несмотря на множество сложностей, которые характеризуют процесс старения, есть сохранение этих молекулярных признаков, лежащих в основе этого процесса черезшироко расходящихся организмов 8,9,10. Выявление изменений в этих путей во время старения привело к осознанию того, что ими можно манипулировать с помощью изменений образа жизни – как показано, ограничение питания существенно продлевает продолжительность жизни вомногих организмах 11. Эти пути сходятся и пересекаются друг с другом и многими другими путями, сложными способами. Выяснение и характеристика этих взаимодействий предлагает потенциал для терапевтических мероприятий для продления жизни и здоровья12,13,14.

Сохранение молекулярной основы старения позволяет функциональное вскрытие генетических взаимодействий, лежащих в основе процесса с помощью более простых организмов модели – в том числе в начинающих дрожжей, Saccharomyces cerevisiae15,16. Существует два установленных типа старения, смоделированных начинающими дрожжами: хронологическое старение (хронологический срок службы, CLS) и репликационные старения (репликационная продолжительность жизни, RLS)17. Хронологическое старение измеряет количество времени, в течение которого клетка может выжить в неразмежавом состоянии. Это аналогично старению, которое наблюдается в клетках, которые проводят большую часть своей жизни в G0,таких как нейроны4. Кроме того, срок службы репликации — это количество раз, которое клетка может разделить до истощения, и является моделью для митотически активных типов клеток (например, количество дочери клеток, которые клетка может иметь)18.

Общая цель этого метода состоит в том, чтобы представить протокол, который позволяет функциональное вскрытие генетики старения с помощью S. cerevisiae. Хотя было много отличных исследований, проведенных многими исследователями, которые привели к нашему нынешнему пониманию, остается много возможностей для начинающих исследователей внести свой вклад в области старения с самого начала их академической карьеры. Мы представляем четкую методологию, которая позволит исследователям дальнейшего продвижения области старения. Этот протокол предназначен для всех исследователей, независимо от стадии их академической карьеры, предоставляя инструменты, необходимые для формулирования и тестирования своих собственных новых гипотез. Преимущество нашего подхода заключается в том, что это экономически эффективный метод, легко доступный для всех исследователей, независимо от института – и не требует дорогостоящего, специализированного оборудования, необходимого для некоторыхпротоколов 19. Есть несколько различных способов разработки этого типа экрана, подход, изложенный в этой работе, особенно подошел к скринингу нулевых мутантов несущественные гены, которые демонстрируют серьезное сокращение хронологического срока службы по сравнению с изогенным диким типом штамма дрожжей.

В качестве нашего доказательства принципа, мы клонировать SIR2, лизин deacetylase сообщили, как экспонирование как расширенный и укороченный CLS при переэкспрессировании. SIR2 переэкспрессии было недавно установлено, увеличить CLS в виноделии дрожжей; однако, несколько групп сообщили никакой связи между РАСШИРЕНИЕм SIR2 и CLS, оставляя своюроль под охарактеризованными 20,,21,22. Из-за этих противоречивых докладов в литературе, мы выбрали этот ген, чтобы добавить независимые исследования, чтобы помочь прояснить роль SIR2 в хронологическом старении, если таковые имеются. Кроме того, увеличение числа копий homologue SIR2 продлевает срок службы в системе модели нематодного червя23.

Аутофагия является внутриклеточной системой деградации для доставки цитозолических продуктов, таких как белки и органеллы, к лизосоме24. Аутофагия тесно связана с долголетием через его роль в деградации поврежденных белков и органелл для поддержания клеточного гомеостаза25. Индукция аутофагии зависит от организации экспрессии многих генов, а удаление гена ATG1 приводит к аномально короткой CLS в начинающих дрожжах26. ATG1 коды для белка серин / трионин киназы, которая необходима для формирования пузырьков в аутофагии и цитоплазмы до вакуола (грибковый лизосомальный эквивалент)путь 27,28. Здесь мы представляем наш метод для увеличения экрана номера копии, проверяя влияние увеличенной копии SIR2 на CLS в диком типе и atg1-null фоне. Этот метод особенно податлив для младших исследователей и исследовательских групп в основном в высших учебных заведениях, многие из которых обслуживают общины, недопредставленные в науке и имеющие ограниченные ресурсы.

Protocol

1. Определить потенциальные генетические взаимодействия для скрининга Определите генетический фон (ы) для характеристики, что приводит к аномально короткой хронологической продолжительности жизни (CLS) в Saccharomyces cerevisiae с помощью базы данных генома Saccharomyces (SGD, https://www.yeastgenome.o…

Representative Results

Поскольку есть противоречивые сообщения о роли SIR2 во время старения, мы выбрали этот ген для изучения в качестве потенциального супрессора мутанта atg1′ сократить CLS фенотип26. Роль SIR2 является несколько спорным, с противоречивыми докладов о своей роли в расшир?…

Discussion

Распутывание генетики старения является трудной задачей, со многими возможностями для дальнейшего изучения, которые потенциально могут дать значительное представление о сложных взаимодействий, которые существуют. Есть много методов, которые позволяют быстрое поколение потери функц…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Джеймс Т. Арноне хотел бы отметить поддержку студентов курса Рекомбинантных технологий ДНК в 2017 и 2018 годах в Университете Уильяма Патерсона, которые участвовали в этом проекте с момента его создания, но чьи усилия не переступили порог авторства: Кристофер Эндино, Хуан Ботеро, Джозефина Бозан, Бренда Калальпа, Бренда Кубас, Хедтлов Ессел Дадзи, Ирвин Гамарра, Драгоценный , Уэйн Ко, Нельсон Мехия, Гектор Моттола, Рабья Наз, Абдулла Одех, Перл Пагунталан, Даниэль Разаи, Габриэлла Ректор, Аида Шоно, и Мэтью Со. Вы великие ученые, и я скучаю по вам всем!

Авторы хотели бы отметить неоценимую поддержку обучения и научно-исследовательских технологий в Университете Уильяма Патерсона за их помощь: Грег Мэттисон, Питер Cannarozzi, Роб Мейер, Данте Портелла, и Генри Heinitsh. Авторы также хотели бы отметить, что Управление проректора по поддержке АРТ, Управление декана и Центр исследований в Колледже науки и здравоохранения поддержали эту работу, а также кафедру биологии за поддержку этого проекта.

Materials

Fungal/Bacterial DNA kit Zymo Research D6005
HindIIIHF enzyme New England Biolabs R3104S
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs M0530S
Plasmid miniprep kit Qiagen 12123
SacII enzyme New England Biolabs R0157S
Salmon sperm DNA Thermofisher AM9680
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202S
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. López-Otín, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
  2. Kenyon, C. The genetics of ageing. Nature. 464 (7288), 504-512 (2010).
  3. Petralia, R. S., Mattson, M. P., Yao, P. J. Aging and longevity in the simplest animals and the quest for immortality. Ageing Research Reviews. 16, 66-82 (2014).
  4. Longo, V. D., Fabrizio, P. . Aging Research in Yeast. , 101-121 (2011).
  5. Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annual Review of Physiology. 75, 685-705 (2013).
  6. Galkin, F., Zhang, B., Dmitriev, S. E., Gladyshev, V. N. Reversibility of irreversible aging. Ageing Research Reviews. 49, 104-114 (2019).
  7. Khan, S. S., Singer, B. D., Vaughan, D. E. Molecular and physiological manifestations and measurement of aging in humans. Aging Cell. 16 (4), 624-633 (2017).
  8. Riera, C. E., Merkwirth, C., De Magalhaes Filho, C. D., Dillin, A. Signaling networks determining life span. Annual Review of Biochemistry. 85, 35-64 (2016).
  9. Powers, R. W., Kaeberlein, M., Caldwell, S. D., Kennedy, B. K., Fields, S. Extension of chronological life span in yeast by decreased TOR pathway signaling. Genes & Development. 20 (2), 174-184 (2006).
  10. Lapierre, L. R., Hansen, M. Lessons from C. elegans: signaling pathways for longevity. Trends in Endocrinology & Metabolism. 23 (12), 637-644 (2012).
  11. Fontana, L., Partridge, L., Longo, V. D. Extending healthy life span-from yeast to humans. Science. 328 (5976), 321-326 (2010).
  12. Houtkooper, R. H., Pirinen, E., Auwerx, J. Sirtuins as regulators of metabolism and healthspan. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (4), 225-238 (2012).
  13. Bitto, A., et al. Transient rapamycin treatment can increase lifespan and healthspan in middle-aged mice. elife. 5, 16351 (2016).
  14. Fang, E. F., et al. NAD+ replenishment improves lifespan and healthspan in ataxia telangiectasia models via mitophagy and DNA repair. Cell Metabolism. 24 (4), 566-581 (2016).
  15. Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. Large-scale identification in yeast of conserved ageing genes. Mechanisms of Ageing and Development. 126 (1), 17-21 (2005).
  16. Fabrizio, P., et al. Genome-wide screen in Saccharomyces cerevisiae identifies vacuolar protein sorting, autophagy, biosynthetic, and tRNA methylation genes involved in life span regulation. PLoS Genetics. 6 (7), (2010).
  17. Longo, V. D., Shadel, G. S., Kaeberlein, M., Kennedy, B. Replicative and chronological aging in Saccharomyces cerevisiae. Cell Metabolism. 16 (1), 18-31 (2012).
  18. He, C., Zhou, C., Kennedy, B. K. The yeast replicative aging model. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Basis of Disease. 1864 (9), 2690-2696 (2018).
  19. Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (13), 4916-4920 (2012).
  20. Fabrizio, P., Longo, V. D. The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae. Aging Cell. 2 (2), 73-81 (2003).
  21. Smith, J., Daniel, L., McClure, J. M., Matecic, M., Smith, J. S. Calorie restriction extends the chronological lifespan of Saccharomyces cerevisiae independently of the Sirtuins. Aging Cell. 6 (5), 649-662 (2007).
  22. Orozco, H., Matallana, E., Aranda, A. Genetic manipulation of longevity-related genes as a tool to regulate yeast life span and metabolite production during winemaking. Microbial Cell Factories. 12 (1), 1 (2013).
  23. Tissenbaum, H. A., Guarente, L. Increased dosage of a sir-2 gene extends lifespan in Caenorhabditis elegans. Nature. 410 (6825), 227-230 (2001).
  24. Huang, W. P., Klionsky, D. J. Autophagy in yeast: a review of the molecular machinery. Cell Structure and Function. 27 (6), 409-420 (2002).
  25. Barbosa, M. C., Grosso, R. A., Fader, C. M. Hallmarks of aging: an autophagic perspective. Frontiers in Endocrinology. 9, 790 (2019).
  26. Aris, J. P., et al. Autophagy and leucine promote chronological longevity and respiration proficiency during calorie restriction in yeast. Experimental Gerontology. 48 (10), 1107-1119 (2013).
  27. Cheong, H., Nair, U., Geng, J., Klionsky, D. J. The Atg1 kinase complex is involved in the regulation of protein recruitment to initiate sequestering vesicle formation for nonspecific autophagy in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 19 (2), 668-681 (2008).
  28. Matsuura, A., Tsukada, M., Wada, Y., Ohsumi, Y. Apg1p, a novel protein kinase required for the autophagic process in Saccharomyces cerevisiae. Gene. 192 (2), 245-250 (1997).
  29. Cherry, J. M., et al. Saccharomyces Genome Database: the genomics resource of budding yeast. Nucleic Acids Research. 40, 700-705 (2012).
  30. Engel, S. R., et al. The reference genome sequence of Saccharomyces cerevisiae: then and now. G3: Genes, Genomes, Genetics. 4 (3), 389-398 (2014).
  31. Imai, S. I., Armstrong, C. M., Kaeberlein, M., Guarente, L. Transcriptional silencing and longevity protein Sir2 is an NAD-dependent histone deacetylase. Nature. 403 (6771), 795-800 (2000).
  32. Sampaio-Marques, B., et al. SNCA (α-synuclein)-induced toxicity in yeast cells is dependent on Sir2-mediated mitophagy. Autophagy. 8 (10), 1494-1509 (2012).
  33. Nagalakshmi, U., et al. The transcriptional landscape of the yeast genome defined by RNA sequencing. Science. 320 (5881), 1344-1349 (2008).
  34. De Boer, C. G., Hughes, T. R. YeTFaSCo: a database of evaluated yeast transcription factor sequence specificities. Nucleic Acids Research. 40, 169-179 (2012).
  35. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. Journal of Visualized Experiments. (63), e3064 (2012).
  36. Gietz, R. D., Woods, R. A. . Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).
  37. Salvi, S., et al. Serum and plasma copy number detection using real-time PCR. Journal of Visualized Experiments. (130), e56502 (2017).
  38. McIsaac, R. S., et al. Visualization and analysis of mRNA molecules using fluorescence in situ hybridization in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Visualized Experiments. (76), e50382 (2013).
  39. Mirisola, M. G., Braun, R. J., Petranovic, D. Approaches to study yeast cell aging and death. FEMS Yeast Research. 14 (1), 109-118 (2014).
  40. Ricardo, R., Phelan, K. Counting and determining the viability of cultured cells. Journal of Visualized Experiments. (16), e752 (2008).
  41. Lin, S. J., Guarente, L. Nicotinamide adenine dinucleotide, a metabolic regulator of transcription, longevity and disease. Current Opinion in Cell Biology. 15 (2), 241-246 (2003).
  42. Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genética. 122 (1), 19-27 (1989).
  43. Romanos, M. A., Scorer, C. A., Clare, J. J. Foreign gene expression in yeast: a review. Yeast. 8 (6), 423-488 (1992).
  44. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research. 29 (9), 45 (2001).
  45. Storici, F., Resnick, M. A. The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast. Methods in Enzymology. 409, 329-345 (2006).
  46. DiCarlo, J. E., et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Research. 41 (7), 4336-4343 (2013).
  47. Arnone, J. T. Genomic Considerations for the Modification of Saccharomyces cerevisiae for Biofuel and Metabolite Biosynthesis. Microorganisms. 8 (3), (2020).
  48. Murakami, C., Kaeberlein, M. Quantifying yeast chronological life span by outgrowth of aged cells. Journal of Visualized Experiments. (27), e1156 (2009).
  49. Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. Measuring replicative life span in the budding yeast. Journal of Visualized Experiments. (28), e1209 (2009).
  50. Huberts, D. H., Janssens, G. E., Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Heinemann, M. Continuous high-resolution microscopic observation of replicative aging in budding yeast. Journal of Visualized Experiments. (78), e50143 (2013).

Tags

Keywords: Suppressor ScreenGenetic LinksChronological LifespanSaccharomyces CerevisiaeAgingDietary RestrictionHallmarks Of AgingBudding YeastAutophagyOver-expression Suppressor Screen
check_url/es/61506?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Dix, C., Sgro, S., Patel, A., Perrotta, C., Eldabagh, N., Lomauro, K. L., Miguez, F. W., Chohan, P., Jariwala, C., Arnone, J. T. A Suppressor Screen for the Characterization of Genetic Links Regulating Chronological Lifespan in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (163), e61506, doi:10.3791/61506 (2020).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image