사카로미세스 cerevisiae에서 연대 수명을 조절하는 유전 링크의 특성화를 위한 억제기 스크린
Summary
다음은 Saccharomyces cerevisiae에서증가 된 복사 번호 억제기 화면을 통해 유전 적 상호 작용을 식별하는 프로토콜입니다. 이 방법을 통해 연구자들은 단명한 효모 돌연변이체에서 억제제를 식별, 복제 및 테스트할 수 있습니다. 우리는 autophagy null 돌연변이의 수명에 SIR2의 복사 수 증가의 효과를 테스트합니다.
Abstract
노화는 사망 확률을 높이는 유기체의 정상적인 생물학적 과정의 시간 의존적 악화입니다. 많은 유전 적 요인은 정상적인 노화 과정의 변경에 기여합니다. 이러한 요인은 많은 유기체에서 확인되고 보존된 문서화된 링크의 부에 의해 입증된 바와 같이 복잡한 방법으로 교차합니다. 이 연구의 대부분은 기능상실, 동시에 많은 유전자의 신속한 스크리닝을 허용하는 널 돌연변이에 초점을 맞추고 있습니다. 이 과정에서 유전자의 과발현 역할을 특성화하는 데 초점을 맞춘 작업이 훨씬 적습니다. 본 연구에서는 신진 효모인 사카로미세스 세레비시아에있는 유전자를 식별하고 복제하는 간단한 방법론을 제시하며, 많은 유전적 배경에서 볼 수 있는 단명한 연대순수 의 억제 연구를 위해. 이 프로토콜은 다양한 배경과 다양한 학술 단계에서 연구원이 접근 할 수 있도록 설계되었습니다. HIStone deacetylase에 대 한 코드 SIR2 유전자, pRS315 벡터에서 복제에 대 한 선택 되었다, 연대 순수에 미치는 영향에 충돌 하는 보고서가 있다. SIR2는 또한 전사 인자 ATG1을포함하여 몇몇 유전자의 삭제를 통해 중단될 때 결과되는 autophagy에 있는 역할을 합니다. 원칙의 증거로, 우리는 SIR2 유전자를 복제하여 자가절 결핍 atg1Δ 돌연변이의 단축된 수명 표현형 특성상 억제기 화면을 수행하고 그렇지 않으면 동종, 야생형 유전배경과 비교한다.
Introduction
노화는 궁극적으로 유기체 죽음의 확률을 증가 무수한 생물학적 과정에서 무결성의 시간 의존 손실이다. 노화는 모든 종에 거의 피할 수 없습니다. 세포 수준에는 유전체 불안정, 후성 유전학 적 변화, 프로테오스타증 손실, 미토콘드리아 기능 장애, 규제 완화 된 영양소 감지, 세포 노화 및 텔로미어 감소1,,2를포함하여 노화와 관련된 몇 가지 잘 특징적인 특징이 있습니다. 효모와 같은 단일 세포 유기체에서, 이것은 복제 잠재력 및 연대기 수명 범위3,4의감소로 이끌어 냅니다.4 이러한 세포 변화는 암, 심부전, 신경 변성, 당뇨병 및 골다공증,5,6,67을포함하는 병리학으로 인간같이 더 복잡한 유기체에서 명시됩니다. 노화 과정을 특징짓는 많은 복잡성에도 불구하고, 널리 발산되는 유기체8,,9,,10에걸쳐 이 과정의 근간이 되는 이러한 분자 특징의 보존이 있다. 노화 중 이러한 경로에 대한 변경의 식별은 그들이 라이프 스타일 변화를 통해 조작 될 수 있다는 실현을 주도 – 식이 제한은 실질적으로 많은 유기체에서 수명을 연장하는 것으로 나타났다11. 이러한 경로는 서로 와 다른 많은 통로와 수렴 하고 복잡한 방법으로 교차합니다. 이러한 상호 작용의 용해 및 특성화는 수명과 건강 기간을 연장하기 위한 치료 적 개입 가능성을 제공한다12,,13,,14.
노화의 분자 기초의 보존은 신진 효모, Saccharomyces cerevisiae15,,16을포함하여 간단한 모형 유기체의 사용을 통해 프로세스의 근본적인 유전 상호 작용의 기능적 해부를 허용합니다. 신진 효모에 의해 모델링 된 노화의 두 가지 유형이 있습니다 : 연대순 노화 (연대순 수명, CLS) 및 복제 노화 (복제 수명, RLS)17. 연대순 노화는 세포가 비분할 상태에서 살아남을 수 있는 시간을 측정합니다. 이것은 뉴런4와같은 G0에서그들의 생활의 대부분을 보내는 세포에서 보이는 노화와 유사합니다. 대안적으로, 복제 수명은 세포가 고갈 되기 전에 나눌 수 있는 횟수이며 미토티컬 활성 세포 유형(예를 들어, 세포가 가질 수 있는 딸 세포의 수)에 대한 모델이다(예를 들어, 세포가 가질 수 있는 딸 세포의수).18.
이 방법의 전반적인 목표는 S. cerevisiae를사용하여 노화의 유전학의 기능적 해부를 허용하는 프로토콜을 제시하는 것입니다. 우리의 현재 이해를 이끌어 온 많은 연구원에 의해 수행된 많은 우수한 연구 결과가 있는 동안, 신진 연구원이 그들의 학문적 경력초기에 에서 노후화필드에 기여하기 위하여 유효한 많은 기회가 남아 있습니다. 우리는 연구원이 노화의 분야를 더 발전시킬 수 있는 명확한 방법론을 제시합니다. 이 프로토콜은 자신의 새로운 가설을 공식화하고 테스트하는 데 필요한 도구를 제공함으로써 학업 경력의 단계에 관계없이 모든 연구자가 액세스 할 수 있도록 설계되었습니다. 우리의 접근 방식의 장점은 이 방법이 기관에 관계없이 모든 연구자가 쉽게 접근 할 수있는 비용 효율적인 방법이며 일부 프로토콜(19)에필요한 고가의 특수 장비를 필요로하지 않는다는 것입니다. 스크린의 이 모형을 디자인하는 몇몇 다른 쪽이 있습니다, 이 일에 설명된 접근은 효모의 동소생성 야생 형 긴장에 비교된 연대순 수명에 있는 가혹한 감소를 나타내는 비 필수 유전자의 null 돌연변이를 선별하는 것이 특히 순종합니다.
원칙의 증거로, 우리는 SIR2를복제, 리신 deacetylase 는 과발 표현 할 때 확장 및 단축 CLS를 모두 전시로보고. SIR2 과발현은 최근 와인 제조 효모에서 CLS를 증가시키는 것으로 나타났습니다. 그러나, 몇몇 그룹은 SIR2와 CLS 확장 사이 아무 링크보고, 특징하에 그것의 역할을 떠나20,,21,,22. 문학에 있는 이 상충하는 보고 때문에, 우리는 연대순 노화에 있는 SIR2의 역할을 명확히 하기 위하여 독립적인 연구를 추가하기 위하여 이 유전자를 선택했습니다, 있는 경우에. 또한, SIR2 호모로그의 복사 수를 늘리면 선충 웜 모델시스템(23)의수명이 연장됩니다.
Autophagy는리소솜(24)에단백질 및 세포기관과 같은 세포질 제품을 전달하는 세포내 분해 시스템이다. Autophagy는 세포 항상성을 유지하기 위하여 손상된 단백질 및 세포기관을 저하시키는 그것의 역할을 통해 장수에 밀접하게 연결됩니다25. 자가식의 유도는 많은 유전자의 발현을 오케스트레이션하는 데 달려 있으며, ATG1 유전자의 삭제는 신진효모(26)에서비정상적으로 짧은 CLS를 초래한다. 자가식 및 세포질-야쿠올(곰팡이 리소냐 에 상응하는)경로(27,,28)에서소포 형성에 필요한 단백질 세린/스레오닌 키나아제에 대한 ATG1 코드. 여기에서는 복사 번호 화면 증가에 대한 방법을 제시하여 야생 유형및 atg1-null배경에서 CLS에 대한 SIR2 복사본 증가효과를 테스트합니다. 이 방법은 특히 주로 학부 기관의 주니어 연구원 및 연구 그룹에 순종하며, 그 중 많은 사람들이 과학분야에서 과소 대표되는 지역 사회에 서비스를 제공하고 자원이 제한적입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
노화의 유전학을 해명하는 것은 어려운 도전이다, 잠재적으로 존재하는 복잡한 상호 작용에 상당한 통찰력을 얻을 수있는 추가 연구를위한 많은 기회와. 효모(45)의,널 균주의 연구를 위한 기능 상실 돌연변이의 신속한 발생을 허용하는 많은 방법이있다. 이 방법은 과발현 억제기 연구를 위한 pRS315 벡터에 유전자를 확인하고 복제하는 간단한 접근 법을 …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
제임스 T. 아르논은 2017년과 2018년 윌리엄 패터슨 대학교에서 이 프로젝트에 참여했지만, 크리스토퍼 안디노, 후안 보테로, 조세핀 보잔, 브렌다 칼알파, 브렌다, 데다, 헤즈러브, 헤즈러브, 헤즈러브, 헤즈러브 , 웨인 코, 넬슨 메지아, 헥터 모톨라, 라비아 나즈, 압둘라 오데, 진주 파군탈란, 다니엘 라자에, 가브리엘라 레토르, 에이다 쇼노, 매튜 소. 당신은 위대한 과학자이고 나는 당신을 모두 그리워!
저자는 그들의 도움을 윌리엄 패터슨 대학에서 교육 및 연구 기술의 귀중한 지원을 인정하고 싶습니다: 그렉 매티슨, 피터 칸나로지, 롭 마이어, 단테 포르텔라, 헨리 하이니츠. 저자는 또한 예술 지원을위한 프로보스트의 사무실, 학장사무실 및 과학 및 건강 대학의 연구 센터, 이 사업을 지원하기위한 생물학부를 인정하고 싶습니다.
Materials
| Fungal/Bacterial DNA kit | Zymo Research | D6005 | |
| HindIIIHF enzyme | New England Biolabs | R3104S | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| Plasmid miniprep kit | Qiagen | 12123 | |
| SacII enzyme | New England Biolabs | R0157S | |
| Salmon sperm DNA | Thermofisher | AM9680 | |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202S |
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