Uma tela supressora para a caracterização de links genéticos regulando a vida cronológica em Saccharomyces cerevisiae

Summary

Aqui está um protocolo para identificar interações genéticas através de uma tela supressora de número de cópia aumentada em Saccharomyces cerevisiae. Este método permite que os pesquisadores identifiquem, clonem e testem supressores em mutantes de levedura de curta duração. Testamos o efeito do aumento do número de cópias de SIR2 na vida útil em um mutante nulo autofagia.

Abstract

O envelhecimento é o tempo dependente da deterioração dos processos biológicos normais de um organismo que aumenta a probabilidade de morte. Muitos fatores genéticos contribuem para alterações no processo normal de envelhecimento. Esses fatores se cruzam de forma complexa, como evidenciado pela riqueza de elos documentados identificados e conservados em muitos organismos. A maioria desses estudos se concentra na perda de função, mutantes nulos que permitem a triagem rápida de muitos genes simultaneamente. Há muito menos trabalho que se concentra em caracterizar o papel que a superexpressão de um gene nesse processo. No presente trabalho, apresentamos uma metodologia simples para identificar e clonar genes na levedura brotante, Saccharomyces cerevisiae, para estudo em supressão do fenótipo cronológico de vida curta visto em muitas origens genéticas. Este protocolo foi projetado para ser acessível a pesquisadores de uma ampla variedade de origens e em vários estágios acadêmicos. O gene SIR2, que codifica uma deacetilase histone, foi selecionado para clonagem no vetor pRS315, pois houve relatos conflitantes sobre seu efeito sobre a vida cronológica. O SIR2 também desempenha um papel na autofagia, que resulta quando interrompida através da exclusão de vários genes, incluindo o fator de transcrição ATG1. Como prova de princípio, clonamos o gene SIR2 para realizar uma tela supressora no fenótipo de vida encurtado característico do mutante atg1Δ deficiente da autofagia e compará-lo com um fundo genético isogênico e selvagem.

Introduction

O envelhecimento é a perda de integridade dependente do tempo em uma miríade de processos biológicos que, em última análise, aumenta a probabilidade de morte organismoal. O envelhecimento é quase inevitável para todas as espécies. Em nível celular, existem várias marcas bem caracterizadas que estão associadas ao envelhecimento, incluindo: instabilidade genômica, alterações epigenéticas, perda de proteostase, disfunção mitocondrial, sensoriamento de nutrientes desregulamentado, senescência celular e atrito de telômero^1,,2. Em organismos unicelulares, como as leveduras, isso leva a uma redução do potencial replicativo e da vida cronológica^3,4. Essas alterações celulares se manifestam em organismos mais complexos, como humanos, como patologias que incluem cânceres, insuficiência cardíaca, neurodegeneração, diabetes e osteoporose^5,,6,7. Apesar das muitas complexidades que caracterizam o processo de envelhecimento, há a conservação dessas marcas moleculares subjacentes a esse processo em organismos amplamente divergentes^8,,9,,10. A identificação dessas vias durante o envelhecimento levou à percepção de que elas podem ser manipuladas através de mudanças no estilo de vida – a restrição alimentar é demonstrada para prolongar substancialmente a vida útil em muitos organismos¹¹. Esses caminhos convergem e se cruzam entre si e muitos outros caminhos, de formas complexas. A elucidação e caracterização dessas interações oferece potencial para intervenções terapêuticas para prolongar a vida útil e a vida saudável^12,,13,,14.

A conservação dos fundamentos moleculares do envelhecimento permite a dissecção funcional das interações genéticas subjacentes ao processo através do uso de organismos modelos mais simples – inclusive na levedura brotante, Saccharomyces cerevisiae^15,16. Existem dois tipos estabelecidos de envelhecimento modelado por levedura brotante: envelhecimento cronológico (a vida cronológica, CLS) e envelhecimento replicativo (a vida útil replicativa, RLS)¹⁷. O envelhecimento cronológico mede a quantidade de tempo que uma célula pode sobreviver em um estado não-divisória. Isso é análogo ao envelhecimento que é visto em células que passam a maior parte de sua vida em G_0,como os neurônios⁴. Alternativamente, a vida útil replicativa é o número de vezes que uma célula pode se dividir antes da exaustão e é um modelo para tipos de células mitoticamente ativas (por exemplo, o número de células filhas que uma célula pode ter)¹⁸.

O objetivo geral deste método é apresentar um protocolo que permita a dissecção funcional da genética do envelhecimento utilizando S. cerevisiae. Embora tenha havido muitos estudos excelentes realizados por muitos pesquisadores que levaram ao nosso entendimento atual, ainda há muitas oportunidades disponíveis para os pesquisadores contribuirem para o campo do envelhecimento desde o início de sua carreira acadêmica. Apresentamos uma metodologia clara que permitirá aos pesquisadores avançar ainda mais no campo do envelhecimento. Este protocolo foi projetado para ser acessível para todos os pesquisadores, independentemente do estágio em sua carreira acadêmica, fornecendo as ferramentas necessárias para formular e testar suas próprias hipóteses novas. A vantagem de nossa abordagem é que este é um método econômico facilmente acessível a todos os pesquisadores independentemente da instituição – e não requer equipamentos caros e especializados necessários para alguns protocolos¹⁹. Existem várias maneiras diferentes de projetar este tipo de tela, a abordagem descrita neste trabalho é particularmente favorável à triagem de mutantes nulos de genes não essenciais que exibem uma redução severa na vida cronológica em comparação com uma cepa isogênica de levedura selvagem.

Como prova de princípio, clonamos o SIR2, uma deacetylase de liseina relatada como exibindo um CLS estendido e encurtado quando superexpresso. A superexpressão SIR2 foi recentemente encontrada para aumentar o CLS em leveduras vinícolas; no entanto, vários grupos não relataram nenhuma ligação entre a extensão SIR2 e a CLS, deixando seu papel sob caracterizado^20,21,22. Devido a esses relatos conflitantes na literatura, selecionamos este gene para adicionar pesquisas independentes para ajudar a esclarecer o papel do SIR2 no envelhecimento cronológico, se houver. Além disso, aumentar o número de cópias de um homólogo SIR2 estende a vida útil em um sistema modelo de verme de nematoides²³.

A autofagia é um sistema de degradação intracelular para fornecer produtos citolíticos, como proteínas e organelas, ao lyssomsome²⁴. A autofagia está intimamente ligada à longevidade através de seu papel na degradação de proteínas e organelas danificadas para manter a homeostase celular²⁵. A indução da autofagia depende da orquestração da expressão de muitos genes, e a exclusão do gene ATG1 resulta em um CLS anormalmente curto na levedura^{brotante 26}. Códigos ATG1 para uma proteína serina/threonina quinase necessária para a formação de vesículas em autofagia e a via citoplasma-para-vacuole (o equivalente fúngico lysosômico)^27,28. Aqui, apresentamos nosso método para uma tela de número de cópia aumentada, testando o efeito do aumento da cópia SIR2 no CLS em um tipo selvagem e um fundo atg1-nulo. Esse método é particularmente favorável a pesquisadores juniores e grupos de pesquisa em instituições de graduação, muitas das quais atendem comunidades sub-representadas nas ciências e têm recursos limitados.

Protocol

1. Identifique interações genéticas potenciais para triagem Identifique o histórico genético para caracterização, que resulta em uma vida cronológica anormalmente curta (CLS) em Saccharomyces cerevisiae usando o Banco de Dados do Genoma de Saccharomyces (o SGD, https://www.yeastgenome.org29,,30), que compila informações fenotípicas conhecidas para este organismo. Selecione a guia Função nas opçõe…

Representative Results

Como há relatos conflitantes sobre o papel do SIR2 durante o envelhecimento, escolhemos este gene para estudo como um potencial supressor do fenótipo CLS do mutante atg1Δ 26. O papel do SIR2 é um tanto controverso, com relatórios conflitantes sobre seu papel na extensão da CLS, porém tem sido claramente ligado ao aumento da CLS em pelo menos um fundo de levedura, com um papel tanto na autofagia quanto na mitofagia22,,<sup class="…

Discussion

Desvendar a genética do envelhecimento é um desafio difícil, com muitas oportunidades para estudos mais aprofundado que podem potencialmente produzir insights significativos sobre as interações complexas que existem. Existem muitos métodos que permitem a rápida geração de mutantes de perda de função para o estudo de cepas nulas de levedura^45,46. Este método apresenta uma abordagem simples para identificar e clonar genes no vetor pRS315 para estudos su…

Materials

Fungal/Bacterial DNA kit	Zymo Research	D6005
HindIIIHF enzyme	New England Biolabs	R3104S
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530S
Plasmid miniprep kit	Qiagen	12123
SacII enzyme	New England Biolabs	R0157S
Salmon sperm DNA	Thermofisher	AM9680
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202S