Una pantalla supresora para la caracterización de los vínculos genéticos que regulan la vida cronológica en Saccharomyces cerevisiae

Summary

Aquí hay un protocolo para identificar interacciones genéticas a través de una mayor pantalla supresora de número de copia en Saccharomyces cerevisiae. Este método permite a los investigadores identificar, clonar y probar supresores en mutantes de levadura de corta duración. Probamos el efecto del aumento del número de copia de SIR2 en la vida útil en un mutante nulo de autofagia.

Abstract

El envejecimiento es el deterioro dependiente del tiempo de los procesos biológicos normales de un organismo que aumenta la probabilidad de muerte. Muchos factores genéticos contribuyen a las alteraciones en el proceso normal de envejecimiento. Estos factores se cruzan de maneras complejas, como lo demuestra la riqueza de enlaces documentados identificados y conservados en muchos organismos. La mayoría de estos estudios se centran en mutantes nulos con pérdida de función que permiten la detección rápida de muchos genes simultáneamente. Hay mucho menos trabajo que se centra en caracterizar el papel que la sobreexpresión de un gen en este proceso. En el presente trabajo, presentamos una metodología sencilla para identificar y clonar genes en la levadura en ciernes, Saccharomyces cerevisiae,para el estudio en la supresión del fenotipo cronológico de corta duración observado en muchos orígenes genéticos. Este protocolo está diseñado para ser accesible a investigadores de una amplia variedad de orígenes y en diversas etapas académicas. El gen SIR2, que codifica para una deacetilasa histona, fue seleccionado para clonar en el vector pRS315, ya que ha habido informes contradictorios sobre su efecto en la vida cronológica. SIR2 también desempeña un papel en la autofagia, que resulta cuando se interrumpe a través de la eliminación de varios genes, incluyendo el factor de transcripción ATG1. Como prueba de principio, clonamos el gen SIR2 para realizar una pantalla supresora en el fenotipo de vida útil acortado característico del mutante atg1 é de autofagia deficiente y lo comparamos con un fondo genético de tipo salvaje isogénico.

Introduction

El envejecimiento es la pérdida de integridad dependiente del tiempo en innumerables procesos biológicos que, en última instancia, aumenta la probabilidad de muerte del organismo. El envejecimiento es casi inevitable para todas las especies. A nivel celular hay varias señas de identidad bien caracterizadas que se asocian con el envejecimiento, incluyendo: inestabilidad genómica, alteraciones epigenéticas, pérdida de proteostasis, disfunción mitocondrial, detección de nutrientes desregulada, senescencia celular, y desgaste de los telómeros^1,2. En organismos unicelulares, como las levaduras, esto conduce a una reducción del potencial replicativo y la vida cronológica^{de 3,4}. Estos cambios celulares se manifiestan en organismos más complejos, como los seres humanos, como patologías que incluyen cánceres, insuficiencia cardíaca, neurodegeneración, diabetes, y osteoporosis^5,6,7. A pesar de las muchas complejidades que caracterizan el proceso de envejecimiento, hay conservación de estas señas de identidad moleculares subyacentes a este proceso a través de organismos ampliamente divergentes^8,,9,,10. La identificación de las alteraciones de estas vías durante el envejecimiento llevó a la comprensión de que pueden ser manipuladas a través de cambios en el estilo de vida – restricción dietética se muestra para extender sustancialmente la vida útil en muchos organismos¹¹. Estos caminos convergen y se cruzan entre sí y muchos otros caminos, de maneras complejas. La elucidación y caracterización de estas interacciones ofrece un potencial de intervenciones terapéuticas para prolongar la vida útil y la salud^12,13,14.

La conservación de los fundamentos moleculares del envejecimiento permite la disección funcional de las interacciones genéticas subyacentes al proceso mediante el uso de organismos modelo más simples, incluso en la levadura en ciernes, Saccharomyces cerevisiae^15,16. Hay dos tipos establecidos de envejecimiento modelados por levaduras en ciernes: envejecimiento cronológico (la vida cronológica, CLS) y envejecimiento replicativo (la vida útil replicativa, RLS)¹⁷. El envejecimiento cronológico mide la cantidad de tiempo que una célula puede sobrevivir en un estado no divisorio. Esto es análogo al envejecimiento que se ve en las células que pasan la mayor parte de su vida en G_0,como las neuronas⁴. Alternativamente, la vida útil replicativa es el número de veces que una celda puede dividir antes del agotamiento y es un modelo para los tipos de celdas mitolíticamente activos (por ejemplo, el número de células hijas que puede tener una celda)¹⁸.

El objetivo general de este método es presentar un protocolo que permita la disección funcional de la genética del envejecimiento utilizando S. cerevisiae. Si bien ha habido muchos estudios excelentes realizados por muchos investigadores que han llevado a nuestra comprensión actual, quedan muchas oportunidades disponibles para que los investigadores en ciernes contribuyan al campo del envejecimiento desde el principio de su carrera académica. Presentamos una metodología clara que permitirá a los investigadores seguir avanzando en el campo del envejecimiento. Este protocolo está diseñado para ser accesible para todos los investigadores independientemente de la etapa de su carrera académica proporcionando las herramientas necesarias para formular y probar sus propias hipótesis novedosas. La ventaja de nuestro enfoque es que este es un método rentable fácilmente accesible para todos los investigadores independientemente de la institución – y no requiere equipos costosos y especializados necesarios para algunos protocolos¹⁹. Hay varias maneras diferentes de diseñar este tipo de pantalla, el enfoque descrito en este trabajo es particularmente susceptible de detección de mutantes nulos de genes no esenciales que exhiben una severa reducción en la vida cronológica en comparación con una cepa de levadura de tipo salvaje isogénico.

Como nuestra prueba de principio, clonamos SIR2, una deacetilasa de lisina reportada como exhibiendo un CLS extendido y acortado cuando está sobreexpresado. Recientemente se encontró que la sobreexpresión de SIR2 aumenta el CLS en las levaduras vitivinícolas; sin embargo, varios grupos no han comunicado ninguna relación entre la extensión SIR2 y CLS, dejando su papel bajo la caracterización^20,21,22. Debido a estos informes contradictorios en la literatura, seleccionamos este gen para agregar investigación independiente para ayudar a aclarar el papel de SIR2 en el envejecimiento cronológico, si existe. Además, el aumento del número de copia de un homólogo SIR2 prolonga la vida útil en un sistema de modelo de gusano nematodo²³.

La autofagia es un sistema de degradación intracelular para suministrar productos citosólicos, como proteínas y orgánulos, al lisosoma^24. La autofagia está íntimamente ligada a la longevidad a través de su papel en la degradación de proteínas dañadas y orgánulos para mantener la homeostasis celular²⁵. La inducción de la autofagia depende de la orquestación de la expresión de muchos genes, y la deleción del gen ATG1 da como resultado un CLS anormalmente corto en levadura en ciernes²⁶. ATG1 codifica para una proteína serina/trotónina quinasa que se requiere para la formación de vesículas en autofagia y la vía de citoplasma a vacuola (equivalente lisosomal fúngico)^27,28. Aquí, presentamos nuestro método para una pantalla de número de copia mayor, probando el efecto del aumento de la copia SIR2 en el CLS en un tipo salvaje y un fondo atg1-null. Este método es particularmente susceptible a investigadores junior y grupos de investigación en instituciones principalmente de pregrado, muchas de las cuales sirven a comunidades subrepresentadas en las ciencias y tienen recursos limitados.

Protocol

1. Identificar posibles interacciones genéticas para el cribado Identificar los antecedentes genéticos para la caracterización, que resulta en una vida cronológica anormalmente corta (CLS) en Saccharomyces cerevisiae utilizando la base de datos del genoma de Saccharomyces (la SGD, https://www.yeastgenome.org29,30), que recopila información fenotípica conocida para este organismo. Seleccione la pestaña Función</s…

Representative Results

Como hay informes contradictorios sobre el papel de SIR2 durante el envejecimiento, elegimos este gen para el estudio como un supresor potencial delfenotipoCLS de acortamiento del mutante atg1 . El papel de SIR2 es algo controvertido, con informes contradictorios sobre su papel en la ampliación de CLS, sin embargo, ha estado claramente relacionado con el aumento de CLS en al menos un fondo de levadura, con un papel tanto en la autofagia como en la mitofagia<sup class="x…

Discussion

Desentrañar la genética del envejecimiento es un desafío difícil, con muchas oportunidades de estudio que potencialmente pueden producir información significativa sobre las complejas interacciones que existen. Hay muchos métodos que permiten la rápida generación de mutantes de pérdida de función para el estudio de cepas nulas de levadura^45,,46. Este método presenta un enfoque sencillo para identificar y clonar genes en el vector pRS315 para estudios de…

Materials

Fungal/Bacterial DNA kit	Zymo Research	D6005
HindIIIHF enzyme	New England Biolabs	R3104S
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530S
Plasmid miniprep kit	Qiagen	12123
SacII enzyme	New England Biolabs	R0157S
Salmon sperm DNA	Thermofisher	AM9680
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202S