Summary

Visualisation de l’innervation immunoréactive du peptide lié au gène de la calcitonine du dura mater crânien de rat avec immunofluorescence et traçage neuronal

Published: January 06, 2021
doi:

Summary

Ici nous présentons un protocole pour visualiser la corrélation spatiale du peptide gène-connexe de calcitonine (CGRP) – fibres nerveuses immunoreactive et vaisseaux sanguins dans le mater crânien de dura utilisant l’immunofluorescence et l’histochimie fluorescente avec CGRP et phalloidin, respectivement. En outre, l’origine de ces fibres nerveuses a été tracée rétrograde avec un traceur neural fluorescent.

Abstract

Le but de cette étude était d’examiner la distribution et l’origine du peptide gène-connexe de calcitonine (CGRP) – fibres nerveuses sensorielles immunoreactive du mater crânien de dura utilisant l’immunofluorescence, la reconstruction (3D) tridimensionnelle et la technique de tracé rétrograde. Ici, les fibres nerveuses et les vaisseaux sanguins ont été souillés utilisant l’immunofluorescence et les techniques histochimiques avec CGRP et le phalloïdine fluorescent, respectivement. La corrélation spatiale des fibres nerveuses CGRP-immuoreactive dural et des vaisseaux sanguins ont été démontrées par reconstruction 3D. Pendant ce temps, l’origine des fibres nerveuses CGRP-immunoreactive ont été détectées par technique neurale de traçage avec le fluorogold (FG) du secteur autour de l’artère méningitique moyenne (MMA) dans le mater crânien de dura au ganglion de trigeminal (TG) et aux ganglions dorsaux cervicaux (C) de racine (DRGs). En outre, les caractéristiques chimiques des neurones FG-marqués dans le TG et le DRGs ont été également examinées ainsi que CGRP utilisant de doubles immunofluorescences. Profitant de l’échantillon transparent de tout-montage et de la reconstruction 3D, on lui a montré que les fibres nerveuses CGRP-immunoreactive et les artérioles phalloidin-étiquetées fonctionnent ensemble ou formant séparément un réseau neurovascular dural dans une vue 3D, alors que les neurones FG-marqués étaient trouvés dans les branches ophtalmiques, maxillaires, et mandibulaires de TG, aussi bien que le C2-3 DRGs ipsilateral du côté de l’application de traceur dans laquelle certains des neurones FG-marqués ont présenté avec l’expression CGRP-immunoreactive. Avec ces approches, nous avons démontré les caractéristiques distributionnelles des fibres nerveuses CGRP-immunoreactive autour des vaisseaux sanguins dans le mater crânien de dura, aussi bien que l’origine de ces fibres nerveuses de TG et de DRGs. Du point de vue de la méthodologie, il peut fournir une référence valable pour comprendre la structure neurovascular compliquée du mater crânien de dura sous l’état physiologique ou pathologique.

Introduction

La dura mater crânienne est la couche la plus externe des méninges pour protéger le cerveau et contient des vaisseaux sanguins abondants et différents types de fibres nerveuses1,2. De nombreuses études ont montré que le dura mater crânien sensibilisé peut être le facteur clé conduisant à l’apparition de maux de tête, impliquant la vasodilatation et l’innervation anormales3,4,5. Ainsi, la connaissance de la structure neurovascular dans le mater crânien de dura est importante pour comprendre la pathogénie des maux de tête, particulièrement pour la migraine.

Bien que l’innervation de dura ait été précédemment étudiée avec l’immunohistochemistry conventionnel, la corrélation spatiale des fibres nerveuses et des vaisseaux sanguins dans le mater crânien de dura ont été moins étudiées6,7,8,9. Afin d’indiquer la structure neurovasculaire dural plus en détail, le peptide gène-connexe de calcitonine (CGRP) et la phalloïdine ont été choisis comme marqueurs pour souiller respectivement les fibres nerveuses dural et les vaisseaux sanguins dans le mater crânien de dura de tout-monter avec l’immunofluorescence et l’histochimie fluorescente10. Il peut s’agir d’un choix optimal pour obtenir une vue tridimensionnelle (3D) de la structure neurovasculaire. En plus, le fluorogold (FG) a été appliqué sur le secteur autour de l’artère méningitique moyenne (MMA) dans le mater crânien de dura pour déterminer l’origine des fibres nerveuses CGRP-immunoreactive, et tracé au ganglion de trigeminal (TG) et aux ganglions dorsaux cervicaux (C) de racine (DRGs), alors que les neurones FG-labeled étaient plus loin examinés ainsi que CGRP utilisant l’immunofluorescence.

Le but de cette étude était de fournir un outil efficace pour étudier la structure neurovascular dans le mater crânien de dura pour l’innervation CGRP-immunoreactive et son origine. En tirant parti du mater transparent de dura de tout-monter et en combinant l’immunofluorescence, le tracé rétrograde, les techniques confocale, et la reconstruction 3D, nous nous attendions à présenter une vue 3D originale de la structure neurovascular dans le mater crânien de dura. Ces approches méthodologiques peuvent être encore servies pour explorer la pathogénie de différents maux de tête.

Protocol

Cette étude a été approuvée par le Comité d’éthique de l’Institut d’acupuncture et de moxibustion de l’Académie chinoise des sciences médicales (numéro de référence D2018-09-29-1). Toutes les procédures ont été effectuées conformément au National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). Douze rats mâles adultes Sprague-Dawley (poids 220 ± 20 g) ont été utilisés dans cette étude. Les animaux [numéro de licence SCX…

Representative Results

Structure neurovasculaire de la dure-mère crânienneAprès la souillure histochimique immunofluorescente et fluorescente avec CGRP et phalloïdine, des fibres nerveuses CGRP-immunoreactive et des artérioles dural phalloïdine-marqués et des tissus conjonctifs ont été clairement démontrés dans tout le mater crânien de dura de montage entier dans un modèle 3D(figure 2C,D, E, F). Il a été montré que les fibres ne…

Discussion

Dans cette étude, nous avons avec succès démontré la distribution et l’origine des fibres nerveuses CGRP-immunoreactive dans le mater crânien de dura utilisant l’immunofluorescence, la reconstruction 3D et les approches neurales de traçage avec l’anticorps CGRP et le traceur neural FG, fournissant les preuves histologiques et chimiques pour mieux comprendre le réseau neurovascular dural.

Comme on le savait, cgrp joue un rôle essentiel dans la pathogénie de la migraine<sup class=…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette étude a été soutenue par le projet du National Key R&D Program of China (code de projet n° 2019YFC1709103; n° 2018YFC1707804) et de la National Natural Science Foundation of China (code de projet n° 81774211; n° 81774432; n° 81801561).

Materials

Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG (H+L) Invitrogen by Thermo Fisher Scientific A21202 Protect from light; RRID: AB_141607
Brain stereotaxis instrument Narishige SR-50
CellSens Dimension Olympus Version 1.1 Software of fluorescent microscope
Confocal imaging system Olympus FV1200
Fluorogold (FG) Fluorochrome 52-9400 Protect from light
Fluorescent imaging system Olympus BX53
Freezing microtome Thermo Microm International GmbH
Olympus FV10-ASW 4.2a Olympus Version 4.2 Confocal image processing software system
Micro Drill Saeyang Microtech Marathon-N7
Mouse anti-CGRP Abcam ab81887 RRID: AB_1658411
Normal donkey serum Jackson ImmunoResearch 017-000-121
Phalloidin 568 Molecular Probes A12380 Protect from light
Photoshop and  Illustration Adobe CS6 Photo editing software
Rabbit anti- Fluorogold Abcam ab153 RRID: AB_90738
Sprague Dawley National Institutes for Food and Drug Control SCXK (JING) 2014-0013
Superfrost plus microscope slides Thermo #4951PLUS-001 25x75x1mm

Referencias

  1. Kekere, V., Alsayouri, K. Anatomy, Head and Neck, Dura Mater. StatPearls. , (2020).
  2. Shimizu, T., et al. Distribution and origin of TRPV1 receptor-containing nerve fibers in the dura mater of rat. Brain Research. 1173, 84-91 (2007).
  3. Jacobs, B., Dussor, G. Neurovascular contributions to migraine: moving beyond vasodilation. Neurociencias. 338, 130-144 (2016).
  4. Dodick, D. W. A phase-by-phase review of migraine pathophysiology. Headache. 58, 4-16 (2018).
  5. Amin, F. M., et al. Investigation of the pathophysiological mechanisms of migraine attacks induced by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-38. Brain: A Journal of Neurology. 137, 779-794 (2014).
  6. Keller, J. T., Marfurt, C. F. Peptidergic and serotoninergic innervation of the rat dura mater. The Journal of Comparative Neurology. 309 (4), 515-534 (1991).
  7. Messlinger, K., Hanesch, U., Baumgärtel, M., Trost, B., Schmidt, R. F. Innervation of the dura mater encephali of cat and rat: ultrastructure and calcitonin gene-related peptide-like and substance P-like immunoreactivity. Anatomy and Embryology. 188 (3), 219-237 (1993).
  8. Lennerz, J. K., et al. Calcitonin receptor-like receptor (CLR), receptor activity-modifying protein 1 (RAMP1), and calcitonin gene-related peptide (CGRP) immunoreactivity in the rat trigeminovascular system: differences between peripheral and central CGRP receptor distribution. The Journal of Comparative Neurology. 507 (3), 1277-1299 (2008).
  9. Eftekhari, S., Warfvinge, K., Blixt, F. W., Edvinsson, L. Differentiation of nerve fibers storing CGRP and CGRP receptors in the peripheral trigeminovascular system. The Journal of Pain: Official Journal of the American Pain Society. 14 (11), 1289-1303 (2013).
  10. Xu, D. S., et al. Characteristics of distribution of blood vessels and nerve fibers in the skin tissues of acupoint “Taichong” (LR3) in the rat. Zhen Ci Yan Jiu. 41 (6), 486-491 (2016).
  11. Cui, J. J., et al. The expression of calcitonin gene-related peptide on the neurons associated Zusanli (ST 36) in rats. Chinese Journal of Integrative Medicine. 21 (8), 630-634 (2015).
  12. Andres, K. H., von Düring, M., Muszynski, K., Schmidt, R. F. Nerve fibres and their terminals of the dura mater encephali of the rat. Anatomy and Embryology. 175 (3), 289-301 (1987).
  13. Leng, C., Chen, L., Li, C. Alteration of P2X1-6 receptor expression in retrograde Fluorogold-labeled DRG neurons from rat chronic neuropathic pain model. Biomedical Reports. 10 (4), 225-230 (2019).
  14. Huang, T. L., et al. Factors influencing the retrograde labeling of retinal ganglion cells with fluorogold in an animal optic nerve crush model. Ophthalmic Research. 51 (4), 173-178 (2014).
  15. Huang, T. L., Chang, C. H., Lin, K. H., Sheu, M. M., Tsai, R. K. Lack of protective effect of local administration of triamcinolone or systemic treatment with methylprednisolone against damages caused by optic nerve crush in rats. Experimental Eye Research. 92 (2), 112-119 (2011).
  16. Tsai, R. K., Chang, C. H., Wang, H. Z. Neuroprotective effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) in neurodegeneration after optic nerve crush in rats. Experimental Eye Research. 87 (3), 242-250 (2008).
  17. Iyengar, S., Ossipov, M. H., Johnson, K. W. The role of calcitonin gene-related peptide in peripheral and central pain mechanisms including migraine. Pain. 158 (4), 543-559 (2017).
  18. Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
  19. Kou, Z. Z., et al. Alterations in the neural circuits from peripheral afferents to the spinal cord: possible implications for diabetic polyneuropathy in streptozotocin-induced type 1 diabetic rats. Frontiers in neural circuits. 8, 6 (2014).
  20. Alarcon-Martinez, L., et al. Capillary pericytes express α-smooth muscle actin, which requires prevention of filamentous-actin depolymerization for detection. eLife. 7, 34861 (2018).
  21. Wang, J., et al. A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).
  22. Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. Central projections of sensory innervation of the rat superior sagittal sinus. Neurociencias. 129, 431-437 (2004).
  23. Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. Central projections of the sensory innervation of the rat middle meningeal artery. Brain Research. 1208, 103-110 (2008).
  24. Schmued, L. C., Fallon, J. H. Fluoro-Gold: a new fluorescent retrograde axonal tracer with numerous unique properties. Brain Research. 377 (1), 147-154 (1986).

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Wang, J., Xu, D., Cui, J., She, C., Wang, H., Wu, S., Zou, L., Zhang, J., Bai, W. Visualizing the Calcitonin Gene-Related Peptide Immunoreactive Innervation of the Rat Cranial Dura Mater with Immunofluorescence and Neural Tracing. J. Vis. Exp. (167), e61742, doi:10.3791/61742 (2021).

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