ラットの脳神経デュラMaterのカルシトニン遺伝子関連ペプチド免疫反応性インナーケイを免疫蛍光と神経トレースによる可視化
Summary
ここでは、CGRPおよびファロイジンを用いた免疫蛍光および蛍光組織化学を用いて、頭蓋デュラマー中のカルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)免疫反応性神経線維および血管の空間相関を可視化するプロトコルを提示する。また、これらの神経線維の起源は、蛍光神経トレーサーで逆行トレースした。
Abstract
本研究の目的は、免疫蛍光、三次元(3D)再構成および逆行トレーシング技術を用いた頭蓋硬膜のカルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)免疫反応性感覚神経線維の分布と起源を調べることであった。ここで、神経線維と血管は、それぞれCGRPおよび蛍光ファロイジンを用いた免疫蛍光および組織化学技術を用いて染色した。硬膜CGRP-インミュール活性神経線維と血管の空間的相関を3D再構成によって実証した。一方、CGRP免疫反応神経線維の起源は、頭蓋頭膜神経節(TG)および子宮頸部側神経節(DrGs)の中髄膜動脈(MMA)周辺領域からフルオロゴールド(FG)を用いた神経学的追跡技術によって検出された。また、TGおよびDRGにおけるFG標識ニューロンの化学的特徴も、二重免疫蛍光を用いたCGRPと併せて調べた。透明な全実装サンプルと3D再構成を利用して、CGRP免疫反応性神経線維とファロイジン標識動脈が一緒に動くか、または別々に3Dビューで神経血管網を形成することを示した、 一方、FG標識ニューロンは、TGの眼、上顎、下顎の枝、およびFG標識ニューロンの一部がCGRP-免疫反応性を示すトレーサー適用の側にC2-3 DRGのイプシララルで発見された。これらのアプローチにより、頭蓋硬膜の血管周囲のCGRP免疫反応性神経線維の分布特性、ならびにTGおよびDRGからのこれらの神経線維の起源を実証した。方法論の観点から、生理学的または病理学的状態下での頭蓋硬膜の複雑な神経血管構造を理解するための貴重な参考文献を提供し得る。
Introduction
頭蓋硬膜は、脳を保護するための髄膜の最外層であり、豊富な血管と神経線維の異なる種類1、2が含まれています。多くの研究は、感作頭蓋硬膜が異常な血管拡張およびインナーベーション3、4、5を含む頭痛の発生につながる重要な要因である可能性があることを示している。したがって、頭蓋硬膜における神経血管構造の知識は、特に片頭痛の発病を理解するために重要である。
硬膜の内膜は従来の免疫検査で以前に研究されてきたが、頭蓋硬膜における神経線維と血管の空間的相関は6、7、8、9より少なかった。より詳細に神経血管構造を明らかにするために、カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)およびファロイジンを、免疫蛍光および蛍光組織化学10を有する全実装頭蓋デュラ・マテルにおける硬膜神経線維および血管をそれぞれ染色するためのマーカーとして選択した。神経血管構造の三次元(3D)ビューを得るのに最適な選択であり得る。さらに、 フルオロゴールド(FG)は、脳神経筋の中髄膜動脈(MMA)周辺領域に適用され、CGRP免疫反応性神経線維の起源を決定し、3叉神経節(TG)および子宮頸部(C)後頭根神経節(DRG)に追跡され、FG標識ニューロンは免疫伝達を用いてさらに一緒に検査した。
本研究の目的は、CGRP免疫反応性の内挿とその起源に対する頭蓋硬膜の神経血管構造を調査するための有効なツールを提供することであった。透明な全実装型DURa materを利用し、免疫蛍光、逆行トレーシング、共焦点技術、および3D再構成を組み合わせることで、頭蓋デュラマーターにおける神経血管構造の新しい3Dビューを提示することが期待された。これらの方法論的アプローチは、異なる頭痛の病因を探索するためにさらに役立つ可能性がある。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究では、免疫蛍光、3D再構成、および神経トレーサーによる神経トレーサによる脳神経障害におけるCGRP免疫反応性神経線維の分布と起源を実証し、神経血管網の理解を深める組織学的および化学的証拠を提供した。
それが知られていたように、CGRPは片頭痛4、17の病因において重要な役割を果たしている。増加したCGRPは、3…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国家キーR&Dプログラム(プロジェクトコード番号2019YFC1709103;No.2018YFC1707804)と中国国立自然科学財団(プロジェクトコード番号81774211;no.81774432;no.818015611)のプロジェクトによって支えられました。
Materials
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | A21202 | Protect from light; RRID: AB_141607 |
| Brain stereotaxis instrument | Narishige | SR-50 | |
| CellSens Dimension | Olympus | Version 1.1 | Software of fluorescent microscope |
| Confocal imaging system | Olympus | FV1200 | |
| Fluorogold (FG) | Fluorochrome | 52-9400 | Protect from light |
| Fluorescent imaging system | Olympus | BX53 | |
| Freezing microtome | Thermo | Microm International GmbH | |
| Olympus FV10-ASW 4.2a | Olympus | Version 4.2 | Confocal image processing software system |
| Micro Drill | Saeyang Microtech | Marathon-N7 | |
| Mouse anti-CGRP | Abcam | ab81887 | RRID: AB_1658411 |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Phalloidin 568 | Molecular Probes | A12380 | Protect from light |
| Photoshop and Illustration | Adobe | CS6 | Photo editing software |
| Rabbit anti- Fluorogold | Abcam | ab153 | RRID: AB_90738 |
| Sprague Dawley | National Institutes for Food and Drug Control | SCXK (JING) 2014-0013 | |
| Superfrost plus microscope slides | Thermo | #4951PLUS-001 | 25x75x1mm |
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