Sıçan Kraniyal Dura Mater'in Kalsitonin Geni ile İlgili Peptid İmmünoreaktif Innervasyonunun İmmünofluoresans ve Nöral İzleme ile Görselleştirilmesi
Summary
Burada, sırasıyla CGRP ve phalloidin ile immünoforezan ve floresan histokmisi kullanarak kraniyal dura materdeki kalsitonin genle ilişkili peptid (CGRP)-immünoreaktif sinir lifleri ve kan damarlarının mekansal korelasyonunu görselleştirmek için bir protokol sunuyoruz. Ek olarak, bu sinir liflerinin kökeni floresan bir nöral izleyici ile retrograd izlenmiştir.
Abstract
Bu çalışmanın amacı immünofluoresans, üç boyutlu (3D) rekonstrüksiyon ve retrograd izleme tekniği kullanılarak kraniyal dura mater’in kalsitonin genle ilişkili peptid (CGRP)-immünoreaktif duyusal sinir liflerinin dağılımını ve kökenini incelemektir. Burada sinir lifleri ve kan damarları sırasıyla CGRP ve floresan phalloidin ile immünofluoresans ve histokrimi teknikleri kullanılarak lekelendi. Dural CGRP-immuoreaktif sinir lifleri ve kan damarlarının mekansal korelasyonu 3D rekonstrüksiyon ile gösterilmiştir. Bu arada, CGRP-immünreaktif sinir liflerinin kökeni, kraniyal dura materdeki orta meningeal arter (MMA) çevresindeki bölgeden trigeminal ganglion (TG) ve servikal (C) sırt kök gangliyonlarına (DRG) florogold (FG) ile nöral izleme tekniği ile saptandı. Ayrıca TG ve DRG’lerdeki FG etiketli nöronların kimyasal özellikleri de çift immünoflüoresans kullanılarak CGRP ile birlikte incelenmiştir. Şeffaf tam montajlı örnek ve 3D rekonstrüksiyondan yararlanarak, CGRP-immünreaktif sinir lifleri ve falloidin etiketli arteriyolların birlikte koştuğu veya 3D görünümde ayrı ayrı bir dural nörovasküler ağ oluşturduğu gösterilmiştir, FG etiketli nöronlar TG’nin oftalmik, maksiller ve mandibular dallarında bulunurken, bazı FG etiketli nöronların CGRP-immünreaktif ekspresyonla sunulduğu izleyici uygulamasının yanına C2-3 DRG’ler ipsilateral bulundu. Bu yaklaşımlarla kraniyal dura materdeki kan damarlarının etrafındaki CGRP-immünreaktif sinir liflerinin dağılım özelliklerinin yanı sıra bu sinir liflerinin kökenini TG ve DRG’lerden gösterdik. Metodoloji açısından bakıldığında, kraniyal dura mater’in fizyolojik veya patolojik durum altındaki karmaşık nörovasküler yapısını anlamak için değerli bir referans sağlayabilir.
Introduction
Kranial dura mater, beyni korumak için en dıştaki menenjit tabakasıdır ve bol miktarda kan damarı ve farklı sinir lifleri içerir1,2. Birçok çalışma, duyarlı kranial dura mater’in anormal vazodilasyon ve innervasyon içeren baş ağrısı oluşumuna yol açan anahtar faktör olabileceğini göstermiştir3,4,5. Bu nedenle, kranial dura materdeki nörovasküler yapı bilgisi, özellikle migren için baş ağrısı patogenezini anlamak için önemlidir.
Dura innervasyonu daha önce konvansiyonel immünhistokimya ile çalışılmış olsa da, kraniyal dura materdeki sinir liflerinin ve kan damarlarının mekansal korelasyonu daha az çalışılmıştır6,7,8,9. Dural nörovasküler yapıyı daha ayrıntılı olarak ortaya çıkarmak için, kalsitonin genle ilişkili peptit (CGRP) ve phalloidin, tüm mount kraniyal dura materdeki dural sinir liflerini ve kan damarlarını immünofluoresan ve floresan histokimya10ile boyamak için belirteçler olarak seçildi. Nörovasküler yapının üç boyutlu (3D) bir görünümünü elde etmek en uygun seçim olabilir. Ek olarak, florogold (FG), CGRP-immünreaktif sinir liflerinin kökenini belirlemek için kraniyal dura materinde orta meningeal arter (MMA) etrafındaki bölgeye uygulandı, trigeminal ganglion (TG) ve servikal (C) dorsal kök gangliyonlarına (DRG) kadar izlenirken, FG etiketli nöronlar immünofluoresans kullanılarak CGRP ile birlikte daha fazla incelendi.
Bu çalışmanın amacı, CGRP-immünreaktif innervasyon ve kökeni için kraniyal dura materdeki nörovasküler yapıyı araştırmak için etkili bir araç sağlamaktı. Şeffaf tam montajlı dura mater’den yararlanarak ve immünofluoresans, retrograd izleme, konfokal teknikler ve 3D rekonstrüksiyonu birleştirerek, kraniyal dura materdeki nörovasküler yapının yeni bir 3D görünümünü sunmayı bekliyorduk. Bu metodolojik yaklaşımlar, farklı baş ağrılarının patogenezini keşfetmek için daha fazla hizmet verebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada, kraniyal dura materdeki CGRP-immünoreaktif sinir liflerinin dağılımını ve kökenini, CGRP antikoru ve FG nöral izleyici ile immünofluoresans, 3D rekonstrüksiyon ve nöral izleme yaklaşımlarını kullanarak, dural nörovasküler ağı daha iyi anlamak için histolojik ve kimyasal kanıtlar sağlayarak başarıyla gösterdik.
Bilindiği gibi, CGRP migren patogenezinde kritik bir rol oynar4,17. Artan CGRP’nin v…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (Proje Kodu no. 2019YFC1709103; no. 2018YFC1707804) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Proje Kodu no. 81774211; no. 81774432; no. 81801561) projesi ile desteklendi.
Materials
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | A21202 | Protect from light; RRID: AB_141607 |
| Brain stereotaxis instrument | Narishige | SR-50 | |
| CellSens Dimension | Olympus | Version 1.1 | Software of fluorescent microscope |
| Confocal imaging system | Olympus | FV1200 | |
| Fluorogold (FG) | Fluorochrome | 52-9400 | Protect from light |
| Fluorescent imaging system | Olympus | BX53 | |
| Freezing microtome | Thermo | Microm International GmbH | |
| Olympus FV10-ASW 4.2a | Olympus | Version 4.2 | Confocal image processing software system |
| Micro Drill | Saeyang Microtech | Marathon-N7 | |
| Mouse anti-CGRP | Abcam | ab81887 | RRID: AB_1658411 |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Phalloidin 568 | Molecular Probes | A12380 | Protect from light |
| Photoshop and Illustration | Adobe | CS6 | Photo editing software |
| Rabbit anti- Fluorogold | Abcam | ab153 | RRID: AB_90738 |
| Sprague Dawley | National Institutes for Food and Drug Control | SCXK (JING) 2014-0013 | |
| Superfrost plus microscope slides | Thermo | #4951PLUS-001 | 25x75x1mm |
Referencias
- Kekere, V., Alsayouri, K. Anatomy, Head and Neck, Dura Mater. StatPearls. , (2020).
- Shimizu, T., et al. Distribution and origin of TRPV1 receptor-containing nerve fibers in the dura mater of rat. Brain Research. 1173, 84-91 (2007).
- Jacobs, B., Dussor, G. Neurovascular contributions to migraine: moving beyond vasodilation. Neurociencias. 338, 130-144 (2016).
- Dodick, D. W. A phase-by-phase review of migraine pathophysiology. Headache. 58, 4-16 (2018).
- Amin, F. M., et al. Investigation of the pathophysiological mechanisms of migraine attacks induced by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-38. Brain: A Journal of Neurology. 137, 779-794 (2014).
- Keller, J. T., Marfurt, C. F. Peptidergic and serotoninergic innervation of the rat dura mater. The Journal of Comparative Neurology. 309 (4), 515-534 (1991).
- Messlinger, K., Hanesch, U., Baumgärtel, M., Trost, B., Schmidt, R. F. Innervation of the dura mater encephali of cat and rat: ultrastructure and calcitonin gene-related peptide-like and substance P-like immunoreactivity. Anatomy and Embryology. 188 (3), 219-237 (1993).
- Lennerz, J. K., et al. Calcitonin receptor-like receptor (CLR), receptor activity-modifying protein 1 (RAMP1), and calcitonin gene-related peptide (CGRP) immunoreactivity in the rat trigeminovascular system: differences between peripheral and central CGRP receptor distribution. The Journal of Comparative Neurology. 507 (3), 1277-1299 (2008).
- Eftekhari, S., Warfvinge, K., Blixt, F. W., Edvinsson, L. Differentiation of nerve fibers storing CGRP and CGRP receptors in the peripheral trigeminovascular system. The Journal of Pain: Official Journal of the American Pain Society. 14 (11), 1289-1303 (2013).
- Xu, D. S., et al. Characteristics of distribution of blood vessels and nerve fibers in the skin tissues of acupoint “Taichong” (LR3) in the rat. Zhen Ci Yan Jiu. 41 (6), 486-491 (2016).
- Cui, J. J., et al. The expression of calcitonin gene-related peptide on the neurons associated Zusanli (ST 36) in rats. Chinese Journal of Integrative Medicine. 21 (8), 630-634 (2015).
- Andres, K. H., von Düring, M., Muszynski, K., Schmidt, R. F. Nerve fibres and their terminals of the dura mater encephali of the rat. Anatomy and Embryology. 175 (3), 289-301 (1987).
- Leng, C., Chen, L., Li, C. Alteration of P2X1-6 receptor expression in retrograde Fluorogold-labeled DRG neurons from rat chronic neuropathic pain model. Biomedical Reports. 10 (4), 225-230 (2019).
- Huang, T. L., et al. Factors influencing the retrograde labeling of retinal ganglion cells with fluorogold in an animal optic nerve crush model. Ophthalmic Research. 51 (4), 173-178 (2014).
- Huang, T. L., Chang, C. H., Lin, K. H., Sheu, M. M., Tsai, R. K. Lack of protective effect of local administration of triamcinolone or systemic treatment with methylprednisolone against damages caused by optic nerve crush in rats. Experimental Eye Research. 92 (2), 112-119 (2011).
- Tsai, R. K., Chang, C. H., Wang, H. Z. Neuroprotective effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) in neurodegeneration after optic nerve crush in rats. Experimental Eye Research. 87 (3), 242-250 (2008).
- Iyengar, S., Ossipov, M. H., Johnson, K. W. The role of calcitonin gene-related peptide in peripheral and central pain mechanisms including migraine. Pain. 158 (4), 543-559 (2017).
- Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
- Kou, Z. Z., et al. Alterations in the neural circuits from peripheral afferents to the spinal cord: possible implications for diabetic polyneuropathy in streptozotocin-induced type 1 diabetic rats. Frontiers in neural circuits. 8, 6 (2014).
- Alarcon-Martinez, L., et al. Capillary pericytes express α-smooth muscle actin, which requires prevention of filamentous-actin depolymerization for detection. eLife. 7, 34861 (2018).
- Wang, J., et al. A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).
- Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. Central projections of sensory innervation of the rat superior sagittal sinus. Neurociencias. 129, 431-437 (2004).
- Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. Central projections of the sensory innervation of the rat middle meningeal artery. Brain Research. 1208, 103-110 (2008).
- Schmued, L. C., Fallon, J. H. Fluoro-Gold: a new fluorescent retrograde axonal tracer with numerous unique properties. Brain Research. 377 (1), 147-154 (1986).
