Visualisierung der Calcitonin Gene-Related Pepact Immunoreactive Innervation der Ratte Cranial Dura Mater mit Immunfluoreszenz und neuronaler Tracing
Summary
Hier stellen wir ein Protokoll zur Visualisierung der räumlichen Korrelation von Calcitonin-Gen-bezogenen Peptid (CGRP)-immunreaktiven Nervenfasern und Blutgefäßen in der Schädel-Dura-Mater unter Verwendung von Immunfluoreszenz bzw. fluoreszierender Histochemie mit CGRP bzw. Phalloidin vor. Darüber hinaus wurde der Ursprung dieser Nervenfasern mit einem fluoreszierenden neuronalen Tracer retrograd nachverfolgt.
Abstract
Ziel dieser Studie war es, die Verteilung und den Ursprung des Calcitonin-Gen-bezogenen Peptids (CGRP)-immunreaktiven sensorischen Nervenfasern der Schädel-Dura-Mater mittels Immunfluoreszenz, dreidimensionaler (3D) Rekonstruktion und retrogradeTracing-Technik zu untersuchen. Hierwurden die Nervenfasern und Blutgefäße mit Immunfluoreszenz- und Histochemietechniken mit CGRP bzw. fluoreszierendem Phalloidin gefärbt. Die räumliche Korrelation von duralen CGRP-immuoreaktiven Nervenfasern und Blutgefäßen wurde durch 3D-Rekonstruktion nachgewiesen. In der Zwischenzeit wurde der Ursprung der CGRP-immunreaktiven Nervenfasern durch neuronale Tracing-Technik mit Fluorgold (FG) aus dem Bereich um die mittlere Meningealarterie (MMA) in der Schädel-Dura-Mater zum trigeminalen Ganglion (TG) und zervikalen (C) dorsalen Wurzelganglien (DRGs) nachgewiesen. Darüber hinaus wurden die chemischen Eigenschaften von FG-markierten Neuronen in den TG und DRGs zusammen mit CGRP mit doppelten Immunfluoreszenzenzen untersucht. Unter Ausnutzung der transparenten Ganzmontageprobe und der 3D-Rekonstruktion wurde gezeigt, dass CGRP-immunreaktive Nervenfasern und phalloidin-markierte Arteriolen zusammenlaufen oder in einer 3D-Ansicht getrennt ein durales neurovaskuläres Netzwerk bilden. während die FG-markierten Neuronen in den ophthalmologischen, kiefer-, unterkiefer- und unterkieferförmigen Zweigen von TG gefunden wurden, sowie die C2-3 DRGs ipsilateral zur Seite der Tracer-Anwendung, in der einige fg-markierte Neuronen mit CGRP-immunreaktiver Expression präsentierten. Mit diesen Ansätzen demonstrierten wir die Verteilungseigenschaften von CGRP-immunreaktiven Nervenfasern um die Blutgefäße in der Schädel-Dura-Mater sowie den Ursprung dieser Nervenfasern aus TG und DRGs. Aus der Perspektive der Methodik kann es eine wertvolle Referenz für das Verständnis der komplizierten neurovaskulären Struktur der Schädel-Dura-Mater unter dem physiologischen oder pathologischen Zustand bieten.
Introduction
Die Schädel-Dura-Mater ist die äußerste Schicht von Hirnhäuschen, um das Gehirn zu schützen und enthält reichlich Blutgefäße und verschiedene Arten von Nervenfasern1,2. Viele Studien haben gezeigt, dass sensibilisierte Schädel-Dura mater kann der Schlüsselfaktor, der das Auftreten von Kopfschmerzen, mit der abnormalen Vasodilatation und Innervation3,4,5. Daher ist das Wissen über die neurovaskuläre Struktur in der Schädel-Dura-Mater wichtig für das Verständnis der Pathogenese von Kopfschmerzen, insbesondere bei Migräne.
Obwohl die Dura-Innervation zuvor mit der konventionellen Immunhistochemie untersucht wurde, wurde die räumliche Korrelation von Nervenfasern und Blutgefäßen in der Schädel-Dura-Mater weniger untersucht6,7,8,9. Um die durale neurovaskuläre Struktur genauer zu zeigen, wurden Calcitonin-Gen-bezogenes Peptid (CGRP) und Phalloidin als Marker für die jeweils Färbung der duralen Nervenfasern und Blutgefäße in der vollbepfebten Kranial-Dura-Mater mit Immunfluoreszenz und fluoreszierender Histochemie10ausgewählt. Es kann eine optimale Wahl sein, um eine dreidimensionale (3D) Ansicht der neurovaskulären Struktur zu erhalten. Zusätzlich wurde Fluorgold (FG) auf dem Gebiet um die mittlere Meningealarterie (MMA) in der Schädel-Dura-Mater angewendet, um den Ursprung von CGRP-immunreaktiven Nervenfasern zu bestimmen, und auf das trigeminale Ganglion (TG) und die zervikale (C) dorsale Wurzelganglien (DRGs) zurückverfolgt, während die FG-markierten Neuronen zusammen mit CGRP weiter untersucht wurden.
Ziel dieser Studie war es, ein wirksames Instrument zur Untersuchung der neurovaskulären Struktur im Schädel-Dura-Mater für die CGRP-immunreaktive Innervation und ihren Ursprung bereitzustellen. Durch die Nutzung des transparenten Vollmontage-Dura-Maters und die Kombination von Immunfluoreszenz, retrogradetracing, konfokalen Techniken und 3D-Rekonstruktion, erwarteten wir, eine neuartige 3D-Ansicht der neurovaskulären Struktur in der Schädel-Dura-Mater zu präsentieren. Diese methodischen Ansätze können weiter zur Erforschung der Pathogenese verschiedener Kopfschmerzen dienen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Studie haben wir erfolgreich die Verteilung und den Ursprung von CGRP-immunreaktiven Nervenfasern in der Schädel-Dura-Mater unter Verwendung von Immunfluoreszenz, 3D-Rekonstruktion und neuronalen Tracing-Ansätzen mit CGRP-Antikörper und FG-neuralem Tracer nachgewiesen, was die histologischen und chemischen Beweise liefert, um das durale neurovaskuläre Netzwerk besser zu verstehen.
Bekanntlich spielt CGRP eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese der Migräne4…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde durch das Projekt des National Key F&D Program of China (Projektcode-Nr. 2019YFC1709103; Nr. 2018YFC1707804) und der National Natural Science Foundation of China (Projektcode-Nr. 81774211; Nr. 81774432; Nr. 81801561) unterstützt.
Materials
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | A21202 | Protect from light; RRID: AB_141607 |
| Brain stereotaxis instrument | Narishige | SR-50 | |
| CellSens Dimension | Olympus | Version 1.1 | Software of fluorescent microscope |
| Confocal imaging system | Olympus | FV1200 | |
| Fluorogold (FG) | Fluorochrome | 52-9400 | Protect from light |
| Fluorescent imaging system | Olympus | BX53 | |
| Freezing microtome | Thermo | Microm International GmbH | |
| Olympus FV10-ASW 4.2a | Olympus | Version 4.2 | Confocal image processing software system |
| Micro Drill | Saeyang Microtech | Marathon-N7 | |
| Mouse anti-CGRP | Abcam | ab81887 | RRID: AB_1658411 |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Phalloidin 568 | Molecular Probes | A12380 | Protect from light |
| Photoshop and Illustration | Adobe | CS6 | Photo editing software |
| Rabbit anti- Fluorogold | Abcam | ab153 | RRID: AB_90738 |
| Sprague Dawley | National Institutes for Food and Drug Control | SCXK (JING) 2014-0013 | |
| Superfrost plus microscope slides | Thermo | #4951PLUS-001 | 25x75x1mm |
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