הדמיה של פפטיד אימונואקטיבי הקשורות לגן קלציטונין של דורה מאטר גולגולת החולדה עם אימונופלואורסצנטיות ומעקב עצבי
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לדמיין מתאם מרחבי של פפטיד הקשורות לגנים קלציטונין (CGRP)-אימונואקטיבי סיבי עצב וכלי דם ב דורה גולגולתי mater באמצעות immunofluorescence והיסטוכימיה פלואורסצנטית עם CGRP ו phalloidin, בהתאמה. בנוסף, מקורם של סיבי עצב אלה היה מדרדר נעוצים במעקב עצבי פלואורסצנטי.
Abstract
מטרת מחקר זה הייתה לבחון את ההתפלגות והמקור של פפטיד הקשורות לגנים קלציטונין (CGRP)-אימונואקטיבי סיבי עצב חושיים של דורה דורה גולגולתית באמצעות immunofluorescence, תלת מימדי (3D) שחזור טכניקת מעקב מדרדר. כאן, סיבי העצב וכלי הדם היו מוכתמים באמצעות כשל חיסוני וטכניקות היסטוכימיה עם CGRP ופאלואידין פלואורסצנטי, בהתאמה. המתאם המרחבי של סיבי עצב CGRP-immuoreactive dural וכלי דם הוכחו על ידי שחזור 3D. בינתיים, המקור של סיבי העצבים CGRP-immunoreactive זוהו על ידי טכניקת מעקב עצבי עם fluorogold (FG) מהאזור סביב עורק קרום המוח האמצעי (MMA) ב דורה גולגולתי מאטר כדי גנגליון trigeminal (TG) וצוואר הרחם (C) גרעיני שורש הגב (DRGs). בנוסף, המאפיינים הכימיים של נוירונים עם תווית FG ב- TG ו- DRGs נבדקו גם יחד עם CGRP באמצעות immunofluorescences כפול. תוך ניצול דגימת ההרה כולה השקופה ושחזור תלת-ממדי, הוכח כי סיבי עצב CGRP-immunoreactive ועורקים עם תווית פאלודין פועלים יחד או יוצרים בנפרד רשת נוירו-וסקולרית דוראלית בתצוגה תלת-ממדית, בעוד נוירונים FG שכותרתו נמצאו בענפים עיניים, maxillary, ו mandibular של TG, כמו גם C2-3 DRGs ipsilateral לצד של יישום מעקב שבו חלק נוירונים FG שכותרתו הציג עם ביטוי CGRP-immunoreactive. עם גישות אלה, הדגמנו את המאפיינים ההפצתיים של סיבי עצב CGRP-immunoreactive סביב כלי הדם ב דורה גולגולתי מאטר, כמו גם את המקור של סיבי עצב אלה מ TG ו DRGs. מנקודת המבט של המתודולוגיה, זה עשוי לספק התייחסות חשובה להבנת המבנה המוחי המסובך של דורה גולגולתי מאטר תחת המצב הפיזיולוגי או הפתולוגי.
Introduction
ה דורה מאטר גולגולתי הוא השכבה החיצונית ביותר של קרום המוח כדי להגן על המוח ומכיל כלי דם בשפע וסוגים שונים של סיבי עצב1,2. מחקרים רבים הראו כי דורה דורה גולגולתית רגישה עשויה להיות הגורם העיקרי המוביל להתרחשות של כאבי ראש, מעורבים vasodilation חריגה innervation3,4,5. לכן, הידע של מבנה neurovascular ב דורה הגולגולתי mater חשוב להבנת הפתוגנזה של כאבי ראש, במיוחד עבור מיגרנה.
למרות innervation דורה נחקרה בעבר עם אימונוהיסטוכימיה קונבנציונאלי, המתאם המרחבי של סיבי עצב וכלי דם ב דורה גולגולתי מאטר נחקרו פחות6,7,8,9. על מנת לחשוף את המבנה הנוירו-וסקולרי הדוראלי ביתר פירוט, פפטיד הקשור לגנים קלציטונין (CGRP) ופאלואידין נבחרו כסמנים להכתמת סיבי העצבים וכלי הדם של דוראלי בכל הר דורה גולגולתי עם כשל חיסוני והיסטוכימיה פלואורסצנטית10. זה עשוי להיות בחירה אופטימלית כדי לקבל תצוגה תלת מימדית (3D) של מבנה neurovascular. בנוסף, fluorogold (FG) יושם על האזור סביב עורק קרום המוח האמצעי (MMA) ב dura הגולגולתי מאטר כדי לקבוע את המקור של סיבי עצב CGRP-immunoreactive, ועקבות גנגליון trigeminal (TG) וצוואר הרחם (C) שורש הגב הגרעיני (DRGs), בעוד נוירונים FG שכותרתו נבדקו יחד עם CGRP באמצעות immunofluscence.
מטרת מחקר זה הייתה לספק כלי יעיל לחקירת המבנה המוחי בדורה הגולגולתי עבור innervation CGRP-immunoreactive ומקורו. על ידי ניצול היתרון של הר דורה מאטר שקוף כולו ושילוב של immunofluorescence, מעקב מדרדר, טכניקות confocal, ושחזור 3D, ציפינו להציג תצוגה תלת-ממדית חדשנית של המבנה הנוירו-וסקולרי בדורה מאטר הגולגולתי. גישות מתודולוגיות אלה עשויות לשמש עוד יותר לחקר הפתוגנזה של כאבי ראש שונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
במחקר זה, הדגמנו בהצלחה את ההתפלגות ואת המקור של סיבי עצב CGRP-immunoreactive בדורא מאטר הגולגולתי באמצעות immunofluorescence, שחזור תלת מימדי וגישות מעקב עצבי עם נוגדן CGRP ומעקב עצבי FG, מתן ראיות היסטולוגיות וכימיות כדי להבין טוב יותר את הרשת neurovascular dural.
כפי שהיה ידוע, CGRP ממלא תפקיד קריטי בפתו…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי הפרויקט של תוכנית המחקר והפיתוח הלאומית של סין (קוד פרויקט מס ‘ 2019YFC1709103; מס ‘ 2018YFC1707804) והקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (קוד פרויקט מס ‘ 81774211; מס ‘ 81774432; מס ‘ 81801561).
Materials
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | A21202 | Protect from light; RRID: AB_141607 |
| Brain stereotaxis instrument | Narishige | SR-50 | |
| CellSens Dimension | Olympus | Version 1.1 | Software of fluorescent microscope |
| Confocal imaging system | Olympus | FV1200 | |
| Fluorogold (FG) | Fluorochrome | 52-9400 | Protect from light |
| Fluorescent imaging system | Olympus | BX53 | |
| Freezing microtome | Thermo | Microm International GmbH | |
| Olympus FV10-ASW 4.2a | Olympus | Version 4.2 | Confocal image processing software system |
| Micro Drill | Saeyang Microtech | Marathon-N7 | |
| Mouse anti-CGRP | Abcam | ab81887 | RRID: AB_1658411 |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Phalloidin 568 | Molecular Probes | A12380 | Protect from light |
| Photoshop and Illustration | Adobe | CS6 | Photo editing software |
| Rabbit anti- Fluorogold | Abcam | ab153 | RRID: AB_90738 |
| Sprague Dawley | National Institutes for Food and Drug Control | SCXK (JING) 2014-0013 | |
| Superfrost plus microscope slides | Thermo | #4951PLUS-001 | 25x75x1mm |
Referencias
- Kekere, V., Alsayouri, K. Anatomy, Head and Neck, Dura Mater. StatPearls. , (2020).
- Shimizu, T., et al. Distribution and origin of TRPV1 receptor-containing nerve fibers in the dura mater of rat. Brain Research. 1173, 84-91 (2007).
- Jacobs, B., Dussor, G. Neurovascular contributions to migraine: moving beyond vasodilation. Neurociencias. 338, 130-144 (2016).
- Dodick, D. W. A phase-by-phase review of migraine pathophysiology. Headache. 58, 4-16 (2018).
- Amin, F. M., et al. Investigation of the pathophysiological mechanisms of migraine attacks induced by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-38. Brain: A Journal of Neurology. 137, 779-794 (2014).
- Keller, J. T., Marfurt, C. F. Peptidergic and serotoninergic innervation of the rat dura mater. The Journal of Comparative Neurology. 309 (4), 515-534 (1991).
- Messlinger, K., Hanesch, U., Baumgärtel, M., Trost, B., Schmidt, R. F. Innervation of the dura mater encephali of cat and rat: ultrastructure and calcitonin gene-related peptide-like and substance P-like immunoreactivity. Anatomy and Embryology. 188 (3), 219-237 (1993).
- Lennerz, J. K., et al. Calcitonin receptor-like receptor (CLR), receptor activity-modifying protein 1 (RAMP1), and calcitonin gene-related peptide (CGRP) immunoreactivity in the rat trigeminovascular system: differences between peripheral and central CGRP receptor distribution. The Journal of Comparative Neurology. 507 (3), 1277-1299 (2008).
- Eftekhari, S., Warfvinge, K., Blixt, F. W., Edvinsson, L. Differentiation of nerve fibers storing CGRP and CGRP receptors in the peripheral trigeminovascular system. The Journal of Pain: Official Journal of the American Pain Society. 14 (11), 1289-1303 (2013).
- Xu, D. S., et al. Characteristics of distribution of blood vessels and nerve fibers in the skin tissues of acupoint “Taichong” (LR3) in the rat. Zhen Ci Yan Jiu. 41 (6), 486-491 (2016).
- Cui, J. J., et al. The expression of calcitonin gene-related peptide on the neurons associated Zusanli (ST 36) in rats. Chinese Journal of Integrative Medicine. 21 (8), 630-634 (2015).
- Andres, K. H., von Düring, M., Muszynski, K., Schmidt, R. F. Nerve fibres and their terminals of the dura mater encephali of the rat. Anatomy and Embryology. 175 (3), 289-301 (1987).
- Leng, C., Chen, L., Li, C. Alteration of P2X1-6 receptor expression in retrograde Fluorogold-labeled DRG neurons from rat chronic neuropathic pain model. Biomedical Reports. 10 (4), 225-230 (2019).
- Huang, T. L., et al. Factors influencing the retrograde labeling of retinal ganglion cells with fluorogold in an animal optic nerve crush model. Ophthalmic Research. 51 (4), 173-178 (2014).
- Huang, T. L., Chang, C. H., Lin, K. H., Sheu, M. M., Tsai, R. K. Lack of protective effect of local administration of triamcinolone or systemic treatment with methylprednisolone against damages caused by optic nerve crush in rats. Experimental Eye Research. 92 (2), 112-119 (2011).
- Tsai, R. K., Chang, C. H., Wang, H. Z. Neuroprotective effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) in neurodegeneration after optic nerve crush in rats. Experimental Eye Research. 87 (3), 242-250 (2008).
- Iyengar, S., Ossipov, M. H., Johnson, K. W. The role of calcitonin gene-related peptide in peripheral and central pain mechanisms including migraine. Pain. 158 (4), 543-559 (2017).
- Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
- Kou, Z. Z., et al. Alterations in the neural circuits from peripheral afferents to the spinal cord: possible implications for diabetic polyneuropathy in streptozotocin-induced type 1 diabetic rats. Frontiers in neural circuits. 8, 6 (2014).
- Alarcon-Martinez, L., et al. Capillary pericytes express α-smooth muscle actin, which requires prevention of filamentous-actin depolymerization for detection. eLife. 7, 34861 (2018).
- Wang, J., et al. A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).
- Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. Central projections of sensory innervation of the rat superior sagittal sinus. Neurociencias. 129, 431-437 (2004).
- Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. Central projections of the sensory innervation of the rat middle meningeal artery. Brain Research. 1208, 103-110 (2008).
- Schmued, L. C., Fallon, J. H. Fluoro-Gold: a new fluorescent retrograde axonal tracer with numerous unique properties. Brain Research. 377 (1), 147-154 (1986).
