Summary

عالية الإنتاجية المضادة للفيروسات المقايسات لفحص لمثبطات تكرار فيروس زيكا

Published: October 30, 2021
doi:

Summary

في هذا العمل، نصف البروتوكولات المستخدمة في المقايسات القائمة على الإنزيمات القائمة على replicon والفيروسية لفحص مثبطات تكرار فيروس زيكا في شكل فحص عالي الإنتاجية.

Abstract

يتطلب اكتشاف الأدوية المضادة للفيروسات تطوير فحوصات بيوكيميائية وخليوية موثوقة يمكن إجراؤها في أشكال الفحص عالي الإنتاجية (HTS). ويعتقد أن البروتينات غير الهيكلية (NS) من الفيروسات الفلافية تتجمع بشكل مشترك على أغشية الشبكية الانتوبلازمية (ER)، مما يشكل مجمع النسخ المتماثل (RC). وNS3 و NS5 هي الإنزيمات الأكثر دراسة من RC وتشكل الأهداف الرئيسية لتطوير المخدرات بسبب أدوارها الحاسمة في تكرار الجينوم الفيروسي. NS3 protease المجال، الذي يتطلب NS2B كمتبرع لها، هي المسؤولة عن انشقاق البوليبروتين الفيروسية غير ناضجة في البروتينات NS ناضجة، في حين أن المجال NS5 RdRp هو المسؤول عن النسخ المتماثل الحمض النووي الريبي. هنا، نصف بالتفصيل البروتوكولات المستخدمة في الفحوصات المستندة إلى الرد والمقايسات الأنزيمية لاختبار المكتبات المركبة الكبيرة لمثبطات تكرار فيروس زيكا (ZIKV). Replicons هي النظم الفرعية ذاتية التكرار التي يتم التعبير عنها في خلايا الثدييات ، والتي يتم فيها استبدال الجينات الهيكلية الفيروسية بجين مراسل. الآثار المثبطة للمركبات على تكرار الحمض النووي الريبي الفيروسي يمكن تقييمها بسهولة عن طريق قياس الانخفاض في نشاط البروتين مراسل. تم إجراء العروض المستندة إلى الرد باستخدام خط خلية BHK-21 ZIKV الذي يعبر عن رينيلا لوسيفيراز كجين مراسل. لتوصيف الأهداف المحددة للمركبات المحددة، أنشأنا المقايسات القائمة على الفلورسينس في المختبر لإعادة دمج protease NS3 و NS5 RdRp. تم قياس النشاط البروتيوليكي للبروتيز الفيروسي باستخدام ركيزة الببتيد الفلورية Bz-nKRR-AMC، في حين تم الكشف عن نشاط استطالة NS5 RdRp مباشرة من خلال زيادة إشارة الفلورسنت من SYBR الأخضر I أثناء استطالة الحمض النووي الريبي ، وذلك باستخدام قالب فتيلة ذاتية التركيب الاصطناعية 3′UTR-U30 (5’biotin-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3′).

Introduction

فيروس زيكا (ZIKV) هو عضو فيروس ناشئ ينتقل عن طريق المفصليات من جنس فيروس فلافي، والذي يتضمن فيروس حمى الضنك (DENV) المرتبط ارتباطا وثيقا ، وفيروس التهاب الدماغ الياباني (JEV) وفيروس الحمى الصفراء (YFV) ، والتي تشكل تهديدات مستمرة للصحة العامة1. حظيت فاشية ZIKV 2015-16 في الأمريكتين باهتمام عالمي بعد ظهورها في البرازيل بسبب ارتباطها باضطرابات عصبية حادة ، مثل صغر الرأس الخلقي المرتبط ب ZIKV عند حديثي الولادة2و3 ومتلازمة غيلان باريه في البالغين4. وعلى الرغم من انخفاض عدد حالات العدوى خلال العامين المقبلين، فقد تم التحقق من انتقال فيروس ZIKV المنقول بالبعوض في 87 بلدا وإقليما في عام 2019، مما يدل على احتمال ية ظهور الفيروس مرة أخرى كجائحة5. حتى الآن، لا توجد لقاحات معتمدة أو أدوية فعالة ضد عدوى ZIKV.

يتطلب اكتشاف الأدوية المضادة للفيروسات تطوير فحوصات خلوية وبيوكيميا حيوية موثوقة يمكن إجراؤها في أشكال فحص عالية الإنتاجية (HTS). تعتبر الفحوصات المستندة إلى Replicon والمقايسات الفيروسية القائمة على الإنزيم استراتيجيتين قيمتين لاختبار مركبات الجزيئات الصغيرة لمثبطات ZIKV1. ويعتقد أن البروتينات غير الهيكلية (NS) الفيروس flavivirus لتجميع ترجمة مشتركة على أغشية الشبكية الانتوبلازمية (ER) ، وتشكيل مجمع النسخ المتماثل (RC)6. وNS3 و NS5 هي الإنزيمات الأكثر دراسة من RC وتشكل الأهداف الرئيسية لتطوير المخدرات بسبب أدوارها الحاسمة في تكرار الجينوم الفيروسي. NS3 protease المجال، الذي يتطلب NS2B كمحترف لها، هي المسؤولة عن انشقاق من البوليبروتين الفيروسية غير ناضجة في البروتينات NS ناضجة، في حين أن المجال NS5 RdRp هو المسؤول عن النسخ المتماثل RNA6.

Replicons هي النظم الفرعية ذاتية التكرار التي يتم التعبير عنها في خلايا الثدييات ، والتي يتم فيها استبدال الجينات الهيكلية الفيروسية بجين مراسل. الآثار المثبطة للمركبات على تكرار الحمض النووي الريبي الفيروسي يمكن تقييمها بسهولة عن طريق قياس الانخفاض في نشاط البروتين مراسل7. هنا ، نصف البروتوكولات المستخدمة لفحص مثبطات تكرار ZIKV في شكل لوحة 96 جيدا. تم إجراء المقايسات المستندة إلى replicon باستخدام خط خلية RLUC ZIKV RLUC BHK-21 الذي قمنا بتطويره مؤخرا8. لتوصيف الأهداف المحددة للمركبات المحددة ، أنشأنا في المختبر المقايسات القائمة على الفلورسينس للتعبير عن NS3 protease باستخدام ركيزة الببتيد الفلورية ، Bz-nKRR-AMC، في حين أننا بالنسبة ل NS5 RdRp قمنا بقياس استطالة القالب الذاتي البدائية الحيوية الاصطناعية 3’UTR-U30 (5’biotin-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3′)، وذلك باستخدام الصبغة المتشابكة SYBR Green I.

تم الحصول على بروتياز ZIKV (45-96 بقايا عامل مساعد NS2B مرتبطة المخلفات 1-177 من مجال بروتياز NS3 بواسطة وصلة غنية بالجليسين [G4SG4]) ، كما هو موضح لYFV9، في حين تم استنساخ البوليمرات (276-898 بقايا مجال RdRp) وأعرب عنها ، كما هو مفصل في10. تم اشتقاق كلا التسلسلين الإنزيمي من GenBank ALU3341.1. كما الفحوص المضادة للفيروسات الأولية, يتم اختبار المركبات في 10 ميكرومتر وتلك التي تظهر الأنشطة ≥ 80٪ ثم يتم تقييم بطريقة تعتمد على الجرعة, مما أدى إلى فعالة / تثبيط (EC50 أو IC50) وتركيزات السامة للخلايا (CC50). في سياق النتائج التمثيلية ، يتم عرض قيم EC50 و CC50 من NITD008 ، وهو مثبط معروف للفيروسات الفلافية11، من الفحوصات المستندة إلى replicon. بالنسبة للمقايسات الأنزيمية، تظهر قيم IC50 لمركبين من صندوق الاستجابة لجائحة MMV/DNDi، وهي مكتبة تتكون من 400 جزيء مع أنشطة مضادة للبكتيريا ومضادة للفطريات ومضادة للفيروسات. يمكن تعديل البروتوكولات الموصوفة في هذا العمل لفحص مثبطات الفيروسات الفلافية الأخرى ذات الصلة.

Protocol

1. Luciferase نشاط المقايسة ملاحظة: تأكد من أن جميع الإجراءات التي تنطوي على ثقافة الخلية تتم في أغطية السلامة البيولوجية المعتمدة (انظر جدول المواد). إعداد وسائل الإعلام النمو تتكون في دولبيكو النسر المعدلة المتوسطة (DMEM) تكمل مع 10٪ FBS و 500 ميكروغرام / مل G418.</…

Representative Results

تم طعن جميع البروتوكولات الموصوفة هنا في لوحات 96 بئرا وتسمح بتقييم 80 مركبا لكل لوحة في فحص أولي لتركيز واحد ، بما في ذلك الضوابط السلبية والإيجابية الموضوعة في العمود الأول والأخير من اللوحات ، على التوالي. يتم تمثيل العروض المستندة إلى replicon في الشكل 1، والذي يتضمن بناء الج…

Discussion

ويمكن تكييف البروتوكولات الموصوفة هنا بسهولة للعروض في أشكال 384 أو 1536 بئرا. بالنسبة للفحوصات الكيميائية الحيوية و/ أو المستندة إلى الخلايا التي يتم إجراؤها في تنسيق HTS ، يتم حساب قيمة عامل Z ، وهي معلمة إحصائية ، لكل لوحة لضمان حساسية واستنساخ ودقة تلك المقايسات12. ومن المتوقع أ?…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وقد دعم هذا العمل صندوق أمبارو à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)، منحة CEPID 2013/07600-3 للذهاب، منحة 2018/05130-3 إلى RSF و2016/19712-9 إلى ASG، وCoordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (منحة 88887.516153/2020-00) إلى ASG. ونود أن نشكر بامتنان مشروعي الطب من أجل الملاريا (MMV، www.mmv.org) ومبادرة أدوية الأمراض المهملة (DNDi، www.dndi.org) على دعمهما وتصميم صندوق الاستجابة للجائحة وتوريد المركبات.

Materials

5'-biotin-U30- ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU -3' Dharmacon 100 ng
96-well cell culture plates KASVI K12-096
96-well PCR Microplate KASVI K4-9610
96-well White Flat Bottom Polystyrene High Bind Microplate Corning 3922
AMC (7-amine-4-methylcoumarine) SIGMA-Aldrich 257370 100 mg
Aprotinin from bovine lung SIGMA-Aldrich A1153 10 mg
ATP JenaBioscience NU-1010-1G 1 g
Bz-nKRR-AMC International Peptides 5 mg
Class II Biohazard Safety Cabinet ESCO
Diethyl pyrocarbonate SIGMA-Aldrich D5758 25 mL
DMSO (Dimethyl sulfoxide) SIGMA-Aldrich 472301 1 L
Dulbecco’s Modified Eagle Medium GIBCO 3760091
Fetal Bovine Serum GIBCO 12657-029 500 mL
G418 SIGMA-Aldrich A1720 Disulfate salt
Glycerol SIGMA-Aldrich G5516 1 L
HERACELL VIOS 160i CO2 incubator Thermo Scientific
MnCl2 tetrahydrate SIGMA-Aldrich 203734 25 g
MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) Invitrogen M6494
NITD008 ≥98% (HPLC) Sigma-Aldrich SML2409 5 mg
qPCR system Mx3000P Agilent
Renilla luciferase Assay System PROMEGA E2810
SpectraMax Gemini EM Fluorescence Reader Molecular Devices
SpectraMax i3 Multi-Mode Detection Platform Molecular Devices
SpectraMax Plus 384 Absorbance Microplate Reader Molecular Devices
SYBR Green I Invitrogen S7563 500 µl
Triton X-100 SIGMA-Aldrich X100 500 mL
Trizma base SIGMA-Aldrich T1503 1 kg
Trypsin-EDTA Solution 1X SIGMA-Aldrich 59417-C 100 mL

Referencias

  1. Zou, J., Shi, P. Y. Strategies for Zika drug discovery. Current Opinion in Virology. 35, 19-26 (2019).
  2. Cugola, F. R., et al. The Brazilian Zika virus strain causes birth defects in experimental models. Nature. 534 (7606), 267-271 (2016).
  3. de Araújo, T. V. B., et al. Association between microcephaly, Zika virus infection, and other risk factors in Brazil: Final report of a case-control study. The Lancet Infectious Diseases. 18 (3), 328-336 (2018).
  4. Cao-Lormeau, V. -. M., et al. Guillain-Barré Syndrome outbreak associated with Zika virus infection in French Polynesia: a case-control study. The Lancet. 387 (10027), 1531-1539 (2016).
  5. Pielnaa, P., et al. Zika virus-spread, epidemiology, genome, transmission cycle, clinical manifestation, associated challenges, vaccine and antiviral drug development. Virology. 543, 34-42 (2020).
  6. Bollati, M., et al. Structure and functionality in flavivirus NS-proteins: Perspectives for drug design Flaviviral NS3 protein Flaviviral NS5 protein Protease Helicase Polymerase Methyltransferase Flavivirus protein structure Antivirals VIZIER Consortium. Antiviral Research. 87, 125-148 (2010).
  7. Fernandes, R. S., et al. Reporter replicons for antiviral drug discovery against positive single-stranded RNA viruses. Viruses. 12 (6), (2020).
  8. Fernandes, R. S., et al. Discovery of an imidazonaphthyridine and a riminophenazine as potent anti-Zika virus agents through a replicon-based high-throughput screening. Virus Research. 299, 198388 (2021).
  9. Noske, G. D., et al. Structural characterization and polymorphism analysis of the NS2B-NS3 protease from the 2017 Brazilian circulating strain of Yellow Fever virus. Biochimica et Biophysica Acta – General Subjects. 1864 (4), 129521 (2020).
  10. Godoy, A. S., et al. Crystal structure of Zika virus NS5 RNA-dependent RNA polymerase. Nature Communications. 8, 14764 (2017).
  11. Yin, Z., et al. An adenosine nucleoside inhibitor of dengue virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (48), 20435-20439 (2009).
  12. Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  13. Brecher, M., Zhang, J., Li, H. The flavivirus protease as a target for drug discovery. Virologica Sinica. 28 (6), 326-336 (2013).
  14. Noble, C. G., Seh, C. C., Chao, A. T., Shi, P. Y. Ligand-bound structures of the dengue virus protease reveal the active conformation. Journal of Virology. 86 (1), 438-446 (2012).
  15. Chen, X., et al. Mechanisms of activation and inhibition of Zika virus NS2B-NS3 protease. Cell Research. 26 (11), 1260-1263 (2016).
  16. Eyer, L., Nencka, R., de Clercq, E., Seley-Radtke, K., Růžek, D. Nucleoside analogs as a rich source of antiviral agents active against arthropod-borne flaviviruses. Antiviral Chemistry and Chemotherapy. 26, (2018).
  17. Xie, X., et al. Zika Virus Replicons for Drug Discovery. EBioMedicine. 12, 156-160 (2016).
  18. Pan, K. L., Lee, J. C., Sung, H. W., Chang, T. Y., Hsu, J. T. A. Development of NS3/4A protease-based reporter assay suitable for efficiently assessing hepatitis C virus infection. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (11), 4825-4834 (2009).
  19. Khumthong, R., Angsuthanasombat, C., Panyim, S., Katzenmeier, G. In Vitro Determination of Dengue Virus Type 2 NS2B-NS3 Protease Activity with Fluorescent Peptide Substrates. Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 35 (2), (2002).
  20. Ulanday, G. E. L., Okamoto, K., Morita, K. Development and utility of an in vitro, fluorescence-based assay for the discovery of novel compounds against dengue 2 viral protease. Tropical Medicine and Health. 44 (1), 1-10 (2016).
  21. Ong, I. L. H., Yang, K. L. Recent developments in protease activity assays and sensors. Analyst. 142 (11), 1867-1881 (2017).
  22. Eltahla, A. A., Lackovic, K., Marquis, C., Eden, J. S., White, P. A. A fluorescence-based high-throughput screen to identify small compound inhibitors of the genotype 3a hepatitis c virus RNA polymerase. Journal of Biomolecular Screening. 18 (9), 1027-1034 (2013).
  23. Eydoux, C., et al. A fluorescence-based high throughput-screening assay for the SARS-CoV RNA synthesis complex. Journal of Virological Methods. 288, 114013 (2021).
  24. Shimizu, H., et al. Discovery of a small molecule inhibitor targeting dengue virus NS5 RNA-dependent RNA polymerase. PLoS Neglected Tropical Diseases. 13 (11), 1-21 (2019).
  25. Sáez-Álvarez, Y., Arias, A., del Águila, C., Agudo, R. Development of a fluorescence-based method for the rapid determination of Zika virus polymerase activity and the screening of antiviral drugs. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).
  26. Kocabas, F., Turan, R. D., Aslan, G. S. Fluorometric RdRp assay with self-priming RNA. Virus Genes. 50 (3), 498-504 (2015).
  27. Niyomrattanakit, P., et al. A fluorescence-based alkaline phosphatase-coupled polymerase assay for identification of inhibitors of dengue virus RNA-Dependent RNA polymerase. Journal of Biomolecular Screening. 16 (2), 201-210 (2011).
  28. Simeonov, A., Davis, M. I. . Interference with Fluorescence and Absorbance Flow Chart Fluorescence Interferences. (Md). , 1-8 (2016).
  29. Genick, C. C., et al. Applications of biophysics in high- Throughput screening hit validation. Journal of Biomolecular Screening. 19 (5), 707-714 (2014).
  30. Smith, T. M., et al. Identifying initiation and elongation inhibitors of dengue virus RNA polymerase in a high-throughput lead-finding campaign. Journal of Biomolecular Screening. 20 (1), 153-163 (2015).
  31. Porecha, R., Herschlag, D. RNA radiolabeling. Methods in enzymology. 530, 255-279 (2013).

Play Video

Citar este artículo
Fernandes, R. S., Noske, G. D., Gawriljuk, V. O., de Oliveira, K. I. Z., Godoy, A. S., Mesquita, N. C. M. R., Oliva, G. High-throughput Antiviral Assays to Screen for Inhibitors of Zika Virus Replication. J. Vis. Exp. (176), e62422, doi:10.3791/62422 (2021).

View Video