Zika Virüs Replikasyonunun inhibitörlerini taramak için yüksek verimli Antiviral Tahliller
Summary
Bu çalışmada, Zika virüsü replikasyonunun inhibitörlerini yüksek verimli bir tarama formatında taramak için replikon bazlı ve viral enzim bazlı tahlillerde kullanılan protokolleri açıklıyoruz.
Abstract
Antiviral ilaç keşfi, yüksek verimli tarama (HTS) formatlarında gerçekleştirilebilen güvenilir biyokimyasal ve hücresel tahlillerin geliştirilmesini gerektirir. Flavivirüs yapısal olmayan (NS) proteinlerin endoplazmik retikül (ER) membranlar üzerinde birlikte bir araya getirilerek replikasyon kompleksini (RC) oluşturduğu düşünülmektedir. NS3 ve NS5, RC’nin en çok çalışılan enzimleridir ve viral genom replikasyonunda önemli rolleri nedeniyle ilaç gelişimi için ana hedefleri oluşturmaktadır. Kofaktör olarak NS2B gerektiren NS3 proteaz etki alanı, olgunlaşmamış viral poliproteinin olgun NS proteinlerine bölünmesinden sorumludur, NS5 RdRp etki alanı ise RNA replikasyondan sorumludur. Burada, Zika virüsü (ZIKV) replikasyonunun inhibitörleri için büyük bileşik kütüphaneleri test etmek için replikon tabanlı taramalarda ve enzymatic tahlillerde kullanılan protokolleri ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Replikonlar, viral yapısal genlerin bir muhabir geni ile değiştirildiği memeli hücrelerinde ifade edilen kendi kendini çoğaltan subgenomik sistemlerdir. Bileşiklerin viral RNA replikasyon üzerindeki inhibitör etkileri, muhabir protein aktivitesindeki azalma ölçülerek kolayca değerlendirilebilir. Replikon bazlı taramalar, Renilla luciferaz’ı muhabir geni olarak ifade eden bhk-21 ZIKV replikon hücre hattı kullanılarak gerçekleştirildi. Tanımlanan bileşiklerin spesifik hedeflerini karakterize etmek için, rekombinant olarak ifade edilen NS3 proteaz ve NS5 RdRp için in-vitro floresan bazlı tahliller kurduk. Viral proteazın proteolitik aktivitesi, florojenik peptit substratı Bz-nKRR-AMC kullanılarak ölçüldü, NS5 RdRp uzama aktivitesi, sentetik biyotinillenmiş kendinden emişli şablon 3′UTR-U30 (5′-biotin-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3′) kullanılarak, RNA uzaması sırasında SYBR Green I’in floresan sinyalinin artmasıyla doğrudan tespit edildi.
Introduction
Zika virüsü (ZIKV), halk sağlığı için sürekli tehditler oluşturan, yakından ilişkili Dang virüsü (DENV), Japon ensefalit virüsü (JEV) ve Sarı Humma virüsünü (YFV) içeren Flaviviruscinsinin gelişmekte olan eklembacaklı kaynaklı bir virüs üyesidir1. Amerika’daki 2015-16 ZIKV salgını, Brezilya’da yenidoğanlarda2,3 ve yetişkinlerde Guillain-Barré sendromu gibi konjenital ZIKV ilişkili mikrosefali gibi ağır nörolojik bozukluklarla ilişkisi nedeniyle ortaya çıkmasının ardından küresel ilgi gördü4. Enfeksiyon vakalarının sayısı önümüzdeki iki yıl boyunca azalsa da, ZIKV’nin otokton sivrisinek kaynaklı bulaşları 2019’da 87 ülke ve bölgede doğrulandı, bu nedenle virüsün bir salgın olarak yeniden ortaya çıkma potansiyeli tahliye edildi5. Bugüne kadar ZIKV enfeksiyonuna karşı onaylanmış aşı veya etkili ilaç bulunmamaktadır.
Antiviral ilaç keşfi, yüksek verimli tarama (HTS) formatlarında gerçekleştirilebilen güvenilir hücresel ve biyokimyasal tahlillerin geliştirilmesini gerektirir. Replikon bazlı taramalar ve viral enzim bazlı tahliller, ZIKV1inhibitörleri için küçük moleküllü bileşikleri test etmek için iki değerli stratejidir. Flavivirüs yapısal olmayan (NS) proteinlerin endoplazmik reticulum (ER) membranları üzerinde birlikte bir araya getirerek replikasyon kompleksini (RC) oluşturduğu düşünülmektedir6. NS3 ve NS5, RC’nin en çok çalışılan enzimleridir ve viral genom replikasyonunda önemli rolleri nedeniyle ilaç gelişimi için ana hedefleri oluşturmaktadır. Kofaktör olarak NS2B gerektiren NS3 proteaz etki alanı, olgunlaşmamış viral poliproteinin olgun NS proteinlerine bölünmesinden sorumludur, NS5 RdRp etki alanı ise RNA replikasyon6.
Replikonlar, viral yapısal genlerin bir muhabir geni ile değiştirildiği memeli hücrelerinde ifade edilen kendi kendini çoğaltan subgenomik sistemlerdir. Bileşiklerin viral RNA replikasyon üzerindeki inhibitör etkileri, muhabir protein aktivitesindeki azalma ölçülerek kolayca değerlendirilebilir7. Burada, ZIKV replikasyonunun inhibitörlerinin taranırlığında kullanılan protokolleri 96 kuyu plaka biçiminde açıklıyoruz. Replicon tabanlı tahliller bhk-21 ZIKV Rluc replicon hücre hattı kullanılarakgerçekleştirildiyakın zamanda geliştirdiğimiz 8 . Tanımlanan bileşiklerin spesifik hedeflerini karakterize etmek için, florojenik peptit substratını kullanarak rekombinant olarak ifade edilen NS3 proteaz için in vitro floresan bazlı tahliller kurduk, Bz-nKRR-AMC, NS5 RdRp için sentetik biyotinillenmiş kendinden emişli şablonun uzamasını ölçtük 3′UTR-U30 (5′-biotin-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3′), intercalating boya SYBR Green I kullanarak.
Glisin zengini bir bağlayıcı [G 4 SG 4 ]) tarafından NS3 proteaz etki alanının 1-177 kalıntılarına bağlı ZIKV proteaz(45-96NS2B kofaktör kalıntısı) elde edildi, YFV9için açıklandığı gibi, polimeraz (RdRp etki alanının 276-898 kalıntısı) klonlandı ve10‘da ayrıntılı olarak açıklandığı gibi ifade edildi. Her iki enzim dizisi de GenBank ALU33341.1’den türetilmiştir. Primer antiviral taramalar olarak bileşikler 10 μM’de test edilir ve aktiviteleri %80’≥ gösterenler doza bağımlı bir şekilde değerlendirilir ve bu da etkili/inhibisyon (EC50 veyaIC 50)ve sitotoksik (CC50)konsantrasyonları ile sonuçlanır. Temsili sonuçlar bağlamında, NITD008’in EC50 ve CC50 değerleri, bilinen bir flavivirüs inhibitörü11, replikon bazlı taramalardan gösterilmiştir. Enzmatik tahliller için, antibakteriyel, antifungal ve antiviral aktiviteli 400 molekülden oluşan bir kütüphane olan MMV/DNDi Pandemi Müdahale Kutusu’ndan iki bileşiğin IC50 değerleri gösterilmiştir. Bu çalışmada açıklanan protokoller, diğer ilgili flavivirüslerin inhibitörlerini taramak için değiştirilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan protokoller, 384 veya 1536 kuyu formatlarındaki gösterimler için kolayca uyarlanabilir. HTS formatında gerçekleştirilen biyokimyasal ve/veya hücre bazlı taramalar için, istatistiksel bir parametre olan Z faktörü değeri, bu tahlillerin hassasiyetini, tekrarlanabilirliğini ve doğruluğunu sağlamak için her plaka için hesaplanır12. Replikon tabanlı taramalar için 0,5 ve üzeri bir Z’ faktör değeri beklenirken, NS3 ve NS5 etkinlik tahlilleri için 0,7 ve üzeri…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), CEPID hibesi 2013/07600-3 tarafından desteklendi. RSF’ye 2018/05130-3 ve ASG’ye 2016/19712-9 ve ASG’ye Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (hibe 88887.516153/2020-00) vermek. Sıtma Girişimleri için İlaç (MMV, www.mmv.org) ve İhmal Edilen Hastalıklar için İlaçlar girişimine (DNDi, www.dndi.org) destekleri, Pandemi Müdahale Kutusu’nun tasarımı ve bileşikleri tedarik ettikleri için minnettar bir şekilde teşekkür ederiz.
Materials
| 5'-biotin-U30- ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU -3' | Dharmacon | – | 100 ng |
| 96-well cell culture plates | KASVI | K12-096 | |
| 96-well PCR Microplate | KASVI | K4-9610 | |
| 96-well White Flat Bottom Polystyrene High Bind Microplate | Corning | 3922 | |
| AMC (7-amine-4-methylcoumarine) | SIGMA-Aldrich | 257370 | 100 mg |
| Aprotinin from bovine lung | SIGMA-Aldrich | A1153 | 10 mg |
| ATP | JenaBioscience | NU-1010-1G | 1 g |
| Bz-nKRR-AMC | International Peptides | – | 5 mg |
| Class II Biohazard Safety Cabinet | ESCO | ||
| Diethyl pyrocarbonate | SIGMA-Aldrich | D5758 | 25 mL |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | SIGMA-Aldrich | 472301 | 1 L |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | GIBCO | 3760091 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 12657-029 | 500 mL |
| G418 | SIGMA-Aldrich | A1720 | Disulfate salt |
| Glycerol | SIGMA-Aldrich | G5516 | 1 L |
| HERACELL VIOS 160i CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| MnCl2 tetrahydrate | SIGMA-Aldrich | 203734 | 25 g |
| MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) | Invitrogen | M6494 | |
| NITD008 ≥98% (HPLC) | Sigma-Aldrich | SML2409 | 5 mg |
| qPCR system Mx3000P | Agilent | ||
| Renilla luciferase Assay System | PROMEGA | E2810 | |
| SpectraMax Gemini EM Fluorescence Reader | Molecular Devices | ||
| SpectraMax i3 Multi-Mode Detection Platform | Molecular Devices | ||
| SpectraMax Plus 384 Absorbance Microplate Reader | Molecular Devices | ||
| SYBR Green I | Invitrogen | S7563 | 500 µl |
| Triton X-100 | SIGMA-Aldrich | X100 | 500 mL |
| Trizma base | SIGMA-Aldrich | T1503 | 1 kg |
| Trypsin-EDTA Solution 1X | SIGMA-Aldrich | 59417-C | 100 mL |
Referencias
- Zou, J., Shi, P. Y. Strategies for Zika drug discovery. Current Opinion in Virology. 35, 19-26 (2019).
- Cugola, F. R., et al. The Brazilian Zika virus strain causes birth defects in experimental models. Nature. 534 (7606), 267-271 (2016).
- de Araújo, T. V. B., et al. Association between microcephaly, Zika virus infection, and other risk factors in Brazil: Final report of a case-control study. The Lancet Infectious Diseases. 18 (3), 328-336 (2018).
- Cao-Lormeau, V. -. M., et al. Guillain-Barré Syndrome outbreak associated with Zika virus infection in French Polynesia: a case-control study. The Lancet. 387 (10027), 1531-1539 (2016).
- Pielnaa, P., et al. Zika virus-spread, epidemiology, genome, transmission cycle, clinical manifestation, associated challenges, vaccine and antiviral drug development. Virology. 543, 34-42 (2020).
- Bollati, M., et al. Structure and functionality in flavivirus NS-proteins: Perspectives for drug design Flaviviral NS3 protein Flaviviral NS5 protein Protease Helicase Polymerase Methyltransferase Flavivirus protein structure Antivirals VIZIER Consortium. Antiviral Research. 87, 125-148 (2010).
- Fernandes, R. S., et al. Reporter replicons for antiviral drug discovery against positive single-stranded RNA viruses. Viruses. 12 (6), (2020).
- Fernandes, R. S., et al. Discovery of an imidazonaphthyridine and a riminophenazine as potent anti-Zika virus agents through a replicon-based high-throughput screening. Virus Research. 299, 198388 (2021).
- Noske, G. D., et al. Structural characterization and polymorphism analysis of the NS2B-NS3 protease from the 2017 Brazilian circulating strain of Yellow Fever virus. Biochimica et Biophysica Acta – General Subjects. 1864 (4), 129521 (2020).
- Godoy, A. S., et al. Crystal structure of Zika virus NS5 RNA-dependent RNA polymerase. Nature Communications. 8, 14764 (2017).
- Yin, Z., et al. An adenosine nucleoside inhibitor of dengue virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (48), 20435-20439 (2009).
- Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Brecher, M., Zhang, J., Li, H. The flavivirus protease as a target for drug discovery. Virologica Sinica. 28 (6), 326-336 (2013).
- Noble, C. G., Seh, C. C., Chao, A. T., Shi, P. Y. Ligand-bound structures of the dengue virus protease reveal the active conformation. Journal of Virology. 86 (1), 438-446 (2012).
- Chen, X., et al. Mechanisms of activation and inhibition of Zika virus NS2B-NS3 protease. Cell Research. 26 (11), 1260-1263 (2016).
- Eyer, L., Nencka, R., de Clercq, E., Seley-Radtke, K., Růžek, D. Nucleoside analogs as a rich source of antiviral agents active against arthropod-borne flaviviruses. Antiviral Chemistry and Chemotherapy. 26, (2018).
- Xie, X., et al. Zika Virus Replicons for Drug Discovery. EBioMedicine. 12, 156-160 (2016).
- Pan, K. L., Lee, J. C., Sung, H. W., Chang, T. Y., Hsu, J. T. A. Development of NS3/4A protease-based reporter assay suitable for efficiently assessing hepatitis C virus infection. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (11), 4825-4834 (2009).
- Khumthong, R., Angsuthanasombat, C., Panyim, S., Katzenmeier, G. In Vitro Determination of Dengue Virus Type 2 NS2B-NS3 Protease Activity with Fluorescent Peptide Substrates. Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 35 (2), (2002).
- Ulanday, G. E. L., Okamoto, K., Morita, K. Development and utility of an in vitro, fluorescence-based assay for the discovery of novel compounds against dengue 2 viral protease. Tropical Medicine and Health. 44 (1), 1-10 (2016).
- Ong, I. L. H., Yang, K. L. Recent developments in protease activity assays and sensors. Analyst. 142 (11), 1867-1881 (2017).
- Eltahla, A. A., Lackovic, K., Marquis, C., Eden, J. S., White, P. A. A fluorescence-based high-throughput screen to identify small compound inhibitors of the genotype 3a hepatitis c virus RNA polymerase. Journal of Biomolecular Screening. 18 (9), 1027-1034 (2013).
- Eydoux, C., et al. A fluorescence-based high throughput-screening assay for the SARS-CoV RNA synthesis complex. Journal of Virological Methods. 288, 114013 (2021).
- Shimizu, H., et al. Discovery of a small molecule inhibitor targeting dengue virus NS5 RNA-dependent RNA polymerase. PLoS Neglected Tropical Diseases. 13 (11), 1-21 (2019).
- Sáez-Álvarez, Y., Arias, A., del Águila, C., Agudo, R. Development of a fluorescence-based method for the rapid determination of Zika virus polymerase activity and the screening of antiviral drugs. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).
- Kocabas, F., Turan, R. D., Aslan, G. S. Fluorometric RdRp assay with self-priming RNA. Virus Genes. 50 (3), 498-504 (2015).
- Niyomrattanakit, P., et al. A fluorescence-based alkaline phosphatase-coupled polymerase assay for identification of inhibitors of dengue virus RNA-Dependent RNA polymerase. Journal of Biomolecular Screening. 16 (2), 201-210 (2011).
- Simeonov, A., Davis, M. I. . Interference with Fluorescence and Absorbance Flow Chart Fluorescence Interferences. (Md). , 1-8 (2016).
- Genick, C. C., et al. Applications of biophysics in high- Throughput screening hit validation. Journal of Biomolecular Screening. 19 (5), 707-714 (2014).
- Smith, T. M., et al. Identifying initiation and elongation inhibitors of dengue virus RNA polymerase in a high-throughput lead-finding campaign. Journal of Biomolecular Screening. 20 (1), 153-163 (2015).
- Porecha, R., Herschlag, D. RNA radiolabeling. Methods in enzymology. 530, 255-279 (2013).
