Summary

Ensaios antivirais de alta produtividade para tela para inibidores da replicação do vírus Zika

Published: October 30, 2021
doi:

Summary

Neste trabalho, descrevemos os protocolos usados em ensaios baseados em enzimas cílicas e virais para triagem de inibidores da replicação do vírus Zika em um formato de triagem de alto rendimento.

Abstract

A descoberta de medicamentos antivirais requer o desenvolvimento de ensaios bioquímicos e celulares confiáveis que podem ser realizados em formatos de triagem de alto rendimento (HTS). Acredita-se que as proteínas não estruturais do flavivírus (NS) se reúnem co-traduzindo nas membranas de rcúlumes endoplasmáticos (ER), formando o complexo de replicação (RC). O NS3 e o NS5 são as enzimas mais estudadas do RC e constituem os principais alvos para o desenvolvimento de drogas devido aos seus papéis cruciais na replicação do genoma viral. O domínio protease NS3, que requer o NS2B como seu cofator, é responsável pelo decote da imatura poliproteína viral nas proteínas NS maduras, enquanto o domínio NS5 RdRp é responsável pela replicação do RNA. Aqui, descrevemos em detalhes os protocolos usados em triagens baseadas em replicon e ensaios enzimáticos para testar grandes bibliotecas compostas para inibidores da replicação do vírus Zika (ZIKV). Os replicons são sistemas subgenômicos auto-replicante expressos em células mamíferas, nas quais os genes estruturais virais são substituídos por um gene repórter. Os efeitos inibitórios dos compostos na replicação viral do RNA podem ser facilmente avaliados medindo a redução da atividade proteica repórter. As triagens baseadas em replicon foram realizadas usando uma linha celular de replicon BHK-21 ZIKV expressando a luciferase de Renilla como um gene repórter. Para caracterizar os alvos específicos dos compostos identificados, estabelecemos ensaios baseados em fluorescência in vitro para protease NS3 e NS5 RdRp recombinantemente expressos. A atividade proteolítica da protease viral foi medida pelo uso do substrato de peptídeo fluorogênico Bz-nKRR-AMC, enquanto a atividade de alongamento do NS5 RdRp foi diretamente detectada pelo aumento do sinal fluorescente do SYBR Green I durante o alongamento do RNA, usando o modelo de auto-priming sintético 3’UTR-U30 (5′-biotin-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3′).

Introduction

O vírus Zika (ZIKV) é um vírus emergente transmitido pelo artrópode do gênero Flavivirus, que inclui o vírus da dengue (DENV) intimamente relacionado, o vírus da encefalite japonesa (JEV) e o vírus da Febre Amarela (YFV), que representam constantes ameaças à saúde pública1. O surto de ZIKV 2015-16 nas Américas recebeu atenção global após seu surgimento no Brasil devido à associação com doenças neurológicas graves, como a microcefalia congênita associada ao ZIKV em recém-nascidos2,3 e síndrome de Guillain-Barré em adultos4. Embora o número de casos de infecção tenha diminuído ao longo dos dois anos seguintes, as transmissões autóctones transmitidas por mosquitos de ZIKV foram verificadas em 87 países e territórios em 2019, evidenciando, portanto, o potencial do vírus para ressurgir como uma epidemia5. Até o momento, não há vacinas aprovadas ou medicamentos eficazes contra a infecção pelo ZIKV.

A descoberta de medicamentos antivirais requer o desenvolvimento de ensaios celulares e bioquímicos confiáveis que podem ser realizados em formatos de triagem de alto rendimento (HTS). As triagens baseadas em replicon e ensaios baseados em enzimas virais são duas estratégias valiosas para testar compostos de pequenas moléculas para inibidores do ZIKV1. Acredita-se que as proteínas não estruturais (NS) do flavivírus são co-traduzinicamente montadas nas membranas de ânticulo endoplasmático (ER), formando o complexo de replicação (RC)6. O NS3 e o NS5 são as enzimas mais estudadas do RC e constituem os principais alvos para o desenvolvimento de drogas devido aos seus papéis cruciais na replicação do genoma viral. O domínio protease NS3, que requer o NS2B como seu cofator, é responsável pelo decote da imaturo poliproteína viral nas proteínas NS maduras, enquanto o domínio NS5 RdRp é responsável pela replicação do RNA6.

Os replicons são sistemas subgenômicos auto-replicante expressos em células mamíferas, nas quais os genes estruturais virais são substituídos por um gene repórter. Os efeitos inibitórios dos compostos na replicação viral do RNA podem ser facilmente avaliados medindo a redução da atividade proteica repórter7. Aqui, descrevemos os protocolos usados para os inibidores de triagem da replicação ZIKV em um formato de placa de 96 poços. Os ensaios baseados em replicon foram realizados usando uma linha celular BHK-21 ZIKV Rluc replicon que desenvolvemos recentemente8. Para caracterizar os alvos específicos dos compostos identificados, estabelecemos ensaios in vitro baseados em fluorescência para protease NS3 recombinantemente expresso usando o substrato de peptídeo fluorogênico, Bz-nKRR-AMC, enquanto para NS5 RdRp medimos o alongamento do modelo de auto-priming sintético 3’UTR-U30 (5′-biotin-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3′), usando o corante intercalante SYBR Green I.

O zikv protease (45-96 resíduos de cofator NS2B ligados a resíduos 1-177 de domínio protease NS3 por um linker rico em glycina [G4SG4]) foi obtido, conforme descrito para YFV9, enquanto a polimerase (276-898 resíduos de domínio RdRp) foi clonada e expressa, conforme detalhado em10. Ambas as sequências enzimáveis foram derivadas do GenBank ALU33341.1. Como triagens antivirais primárias, os compostos são testados a 10 μM e aqueles que mostram atividades ≥ 80% são então avaliados de forma dependente de dose, resultando nas concentrações efetiva/inibição (EC50 ou IC50) e nas concentrações citotóxicas (CC50). No contexto dos resultados representativos, são mostrados os valores EC50 e CC50 de NITD008, um conhecido inibidor de flavivírus11, a partir de triagens baseadas em replicon. Para os ensaios enzimáticos, são mostrados os valores IC50 de dois compostos da Caixa de Resposta Pandêmica MMV/DNDi, uma biblioteca composta por 400 moléculas com atividades antibacterianas, antifúnggicas e antivirais. Os protocolos descritos neste trabalho poderiam ser modificados para triagem de inibidores de outros flavivírus relacionados.

Protocol

1. Ensaio de atividade de luciferase NOTA: Certifique-se de que todos os procedimentos envolvendo cultura celular sejam realizados em capas de biossegurança certificadas (ver Tabela de Materiais). Prepare a mídia de crescimento composta pelo DMEM (Modified Eagle’s Medium, do Dulbecco) complementado com 10% de FBS e 500 μg/mL G418. Prepare uma solução de estoque de 10 mM de compostos testados em 100% DMSO e, em seguida, dilua-os para 1 …

Representative Results

Todos os protocolos aqui descritos foram estabelecidos em placas de 96 poços e permite a avaliação de 80 compostos por placa em uma triagem primária de uma única concentração, incluindo os controles negativos e positivos colocados na primeira e última coluna das placas, respectivamente. As triagens baseadas em replicon estão representadas na Figura 1, que inclui o construto de RNA desenvolvido para obter a linha celular BHK-21-RepZIKV_IRES-Neo(Figura 1A),</stron…

Discussion

Os protocolos aqui descritos poderiam ser prontamente adaptados para exibições em formatos 384 ou 1536-well. Para triagens bioquímicas e/ou baseadas em células realizadas em formato HTS, o valor fator Z, um parâmetro estatístico, é calculado para cada placa para garantir a sensibilidade, reprodutibilidade e precisão desses ensaios12. Um valor fator Z de 0,5 ou mais é esperado para triagens baseadas em replicon, enquanto um valor de 0,7 ou mais é esperado para os ensaios de atividade NS3 …

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), concessão do CEPID 2013/07600-3 para GO, conceder 2018/05130-3 à RSF e 2016/19712-9 à ASG, e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (subvenção 88887.516153/2020-00) à ASG. Gostaríamos de agradecer agradecendo à Medicina para a Malária Ventures (MMV, www.mmv.org) e à iniciativa Drogas para Doenças Negligenciadas (DNDi, www.dndi.org) pelo apoio, pelo projeto da Caixa de Resposta Pandêmica e pelo fornecimento dos compostos.

Materials

5'-biotin-U30- ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU -3' Dharmacon 100 ng
96-well cell culture plates KASVI K12-096
96-well PCR Microplate KASVI K4-9610
96-well White Flat Bottom Polystyrene High Bind Microplate Corning 3922
AMC (7-amine-4-methylcoumarine) SIGMA-Aldrich 257370 100 mg
Aprotinin from bovine lung SIGMA-Aldrich A1153 10 mg
ATP JenaBioscience NU-1010-1G 1 g
Bz-nKRR-AMC International Peptides 5 mg
Class II Biohazard Safety Cabinet ESCO
Diethyl pyrocarbonate SIGMA-Aldrich D5758 25 mL
DMSO (Dimethyl sulfoxide) SIGMA-Aldrich 472301 1 L
Dulbecco’s Modified Eagle Medium GIBCO 3760091
Fetal Bovine Serum GIBCO 12657-029 500 mL
G418 SIGMA-Aldrich A1720 Disulfate salt
Glycerol SIGMA-Aldrich G5516 1 L
HERACELL VIOS 160i CO2 incubator Thermo Scientific
MnCl2 tetrahydrate SIGMA-Aldrich 203734 25 g
MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) Invitrogen M6494
NITD008 ≥98% (HPLC) Sigma-Aldrich SML2409 5 mg
qPCR system Mx3000P Agilent
Renilla luciferase Assay System PROMEGA E2810
SpectraMax Gemini EM Fluorescence Reader Molecular Devices
SpectraMax i3 Multi-Mode Detection Platform Molecular Devices
SpectraMax Plus 384 Absorbance Microplate Reader Molecular Devices
SYBR Green I Invitrogen S7563 500 µl
Triton X-100 SIGMA-Aldrich X100 500 mL
Trizma base SIGMA-Aldrich T1503 1 kg
Trypsin-EDTA Solution 1X SIGMA-Aldrich 59417-C 100 mL

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Citar este artículo
Fernandes, R. S., Noske, G. D., Gawriljuk, V. O., de Oliveira, K. I. Z., Godoy, A. S., Mesquita, N. C. M. R., Oliva, G. High-throughput Antiviral Assays to Screen for Inhibitors of Zika Virus Replication. J. Vis. Exp. (176), e62422, doi:10.3791/62422 (2021).

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