Tests antiviraux à haut débit pour dépister les inhibiteurs de la réplication du virus Zika
Summary
Dans ce travail, nous décrivons les protocoles utilisés dans les tests à base de réplicon et à base d’enzymes virales pour dépister les inhibiteurs de la réplication du virus Zika dans un format de dépistage à haut débit.
Abstract
La découverte de médicaments antiviraux nécessite le développement de tests biochimiques et cellulaires fiables qui peuvent être effectués dans des formats de criblage à haut débit (HTS). On pense que les protéines non structurelles (NS) du flavivirus s’assemblent de manière co-translationnelle sur les membranes du réticulum endoplasmique (ER), formant le complexe de réplication (RC). Les NS3 et NS5 sont les enzymes les plus étudiées de la RC et constituent les principales cibles du développement de médicaments en raison de leur rôle crucial dans la réplication du génome viral. Le domaine de la protéase NS3, qui nécessite NS2B comme cofacteur, est responsable du clivage de la polyprotéine virale immature dans les protéines NS matures, tandis que le domaine NS5 RdRp est responsable de la réplication de l’ARN. Ici, nous décrivons en détail les protocoles utilisés dans les dépistages basés sur la réplication et les tests enzymatiques pour tester de grandes bibliothèques de composés pour les inhibiteurs de la réplication du virus Zika (ZIKV). Les replicons sont des systèmes sous-économiques auto-réplicants exprimés dans les cellules de mammifères, dans lesquels les gènes structurels viraux sont remplacés par un gène rapporteur. Les effets inhibiteurs des composés sur la réplication de l’ARN viral peuvent être facilement évalués en mesurant la réduction de l’activité de la protéine rapporteure. Les dépistages basés sur la réplicon ont été effectués à l’aide d’une lignée cellulaire de réplicon BHK-21 ZIKV exprimant la renilla luciférase en tant que gène rapporteur. Pour caractériser les cibles spécifiques des composés identifiés, nous avons établi des essais in vitro basés sur la fluorescence pour la protéase NS3 exprimée par recombinaison et le RdRp NS5. L’activité protéolytique de la protéase virale a été mesurée en utilisant le substrat peptidique fluorogénique Bz-nKRR-AMC, tandis que l’activité d’allongement NS5 RdRp a été directement détectée par l’augmentation du signal fluorescent de SYBR Green I pendant l’allongement de l’ARN, en utilisant le modèle d’auto-amorçage biotinylé synthétique 3′UTR-U30 (5′-biotine-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3′).
Introduction
Le virus Zika (ZIKV) est un nouveau virus transmis par les arthropodes du genre Flavivirus,qui comprend le virus de la dengue (DENV), le virus de l’encéphalite japonaise (JEV) et le virus de la fièvre jaune (YFV), qui constituent des menaces constantes pour la santé publique1. L’épidémie de ZIKV de 2015-2016 dans les Amériques a attiré l’attention du monde entier après son émergence au Brésil en raison de l’association avec des troubles neurologiques graves, tels que la microcéphalie congénitale associée au ZIKV chez les nouveau-nés2,3 et le syndrome de Guillain-Barré chez les adultes4. Bien que le nombre de cas d’infection ait diminué au cours des deux années suivantes, les transmissions autochtones de ZIKV transmises par les moustiques ont été vérifiées dans 87 pays et territoires en 2019, ce qui témoigne du potentiel du virus à réapparaître en tant qu’épidémie5. À ce jour, il n’existe aucun vaccin approuvé ou médicament efficace contre l’infection par le ZIKV.
La découverte de médicaments antiviraux nécessite le développement de tests cellulaires et biochimiques fiables qui peuvent être effectués dans des formats de criblage à haut débit (HTS). Les dépistages à base de réplicon et les tests à base d’enzymes virales sont deux stratégies précieuses pour tester les composés à petites molécules pour les inhibiteurs du ZIKV1. On pense que les protéines non structurelles (NS) du flavivirus s’assemblent de manière co-translationnelle sur les membranes du réticulum endoplasmique (ER), formant le complexe de réplication (RC)6. Les NS3 et NS5 sont les enzymes les plus étudiées de la RC et constituent les principales cibles du développement de médicaments en raison de leur rôle crucial dans la réplication du génome viral. Le domaine de la protéase NS3, qui nécessite NS2B comme cofacteur, est responsable du clivage de la polyprotéine virale immature dans les protéines NS matures, tandis que le domaine NS5 RdRp est responsable de la réplication de l’ARN6.
Les replicons sont des systèmes sous-économiques auto-réplicants exprimés dans les cellules de mammifères, dans lesquels les gènes structurels viraux sont remplacés par un gène rapporteur. Les effets inhibiteurs des composés sur la réplication de l’ARN viral peuvent être facilement évalués en mesurant la réduction de l’activité de la protéinerapporteure 7. Nous décrivons ici les protocoles utilisés pour le dépistage des inhibiteurs de la réplication du ZIKV dans un format de plaque à 96 puits. Les tests à base de réplicon ont été effectués à l’aide d’une lignée cellulaire BHK-21 ZIKV Rluc replicon que nous avons récemment développée8. Pour caractériser les cibles spécifiques des composés identifiés, nous avons établi des tests in vitro basés sur la fluorescence pour la protéase NS3 exprimée par recombinaison en utilisant le substrat peptidique fluorogénique, Bz-nKRR-AMC, tandis que pour NS5 RdRp, nous avons mesuré l’allongement du modèle d’auto-amorçage biotinylé synthétique 3′UTR-U30 (5′-biotine-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3′), en utilisant le colorant intercalant SYBR Green I.
La protéase ZIKV (45-96 résidus de cofacteur NS2B liés aux résidus 1-177 du domaine protéase NS3 par un liant riche en glycine [G4SG4]) a été obtenue, comme décrit pour YFV9,tandis que la polymérase (276-898 résidus du domaine RdRp) a été clonée et exprimée, comme détaillé dans10. Les deux séquences enzymatiques ont été dérivées de GenBank ALU33341.1. En tant que dépistages antiviraux primaires, les composés sont testés à 10 μM et ceux dont les activités sont ≥ 80% sont ensuite évalués de manière dose-dépendante, ce qui entraîne les concentrations efficaces/inhibition (EC50 ou IC50)et cytotoxiques (CC50). Dans le contexte de résultats représentatifs, les valeurs EC50 et CC50 de NITD008, un inhibiteur connu des flavivirus11, issus de dépistages basés sur la réplicône sont montrées. Pour les tests enzymatiques, les valeurs IC50 de deux composés de la boîte de réponse pandémique MMV/DNDi, une bibliothèque composée de 400 molécules ayant des activités antibactériennes, antifongiques et antivirales, sont présentées. Les protocoles décrits dans ce travail pourraient être modifiés pour dépister les inhibiteurs d’autres flavivirus apparentés.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les protocoles décrits ici pourraient être facilement adaptés pour les projections dans un format 384 ou 1536 puits. Pour les criblages biochimiques et/ou cellulaires effectués au format HTS, la valeur du facteur Z’, un paramètre statistique, est calculée pour chaque plaque afin d’assurer la sensibilité, la reproductibilité et la précision de ces essais12. Une valeur factorielle Z de 0,5 ou plus est attendue pour les dépistages basés sur la réplicône, tandis qu’une valeur de 0,7 o…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), la subvention CEPID 2013/07600-3 à GO, la subvention 2018/05130-3 à RSF et 2016/19712-9 à ASG, et la Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (subvention 88887.516153/2020-00) à ASG. Nous tenons à remercier l’initiative Medicine for Malaria Ventures (MMV, www.mmv.org) et Drugs for Neglected Diseases (DNDi, www.dndi.org) pour leur soutien, la conception de la boîte d’intervention en cas de pandémie et la fourniture des composés.
Materials
| 5'-biotin-U30- ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU -3' | Dharmacon | – | 100 ng |
| 96-well cell culture plates | KASVI | K12-096 | |
| 96-well PCR Microplate | KASVI | K4-9610 | |
| 96-well White Flat Bottom Polystyrene High Bind Microplate | Corning | 3922 | |
| AMC (7-amine-4-methylcoumarine) | SIGMA-Aldrich | 257370 | 100 mg |
| Aprotinin from bovine lung | SIGMA-Aldrich | A1153 | 10 mg |
| ATP | JenaBioscience | NU-1010-1G | 1 g |
| Bz-nKRR-AMC | International Peptides | – | 5 mg |
| Class II Biohazard Safety Cabinet | ESCO | ||
| Diethyl pyrocarbonate | SIGMA-Aldrich | D5758 | 25 mL |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | SIGMA-Aldrich | 472301 | 1 L |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | GIBCO | 3760091 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 12657-029 | 500 mL |
| G418 | SIGMA-Aldrich | A1720 | Disulfate salt |
| Glycerol | SIGMA-Aldrich | G5516 | 1 L |
| HERACELL VIOS 160i CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| MnCl2 tetrahydrate | SIGMA-Aldrich | 203734 | 25 g |
| MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) | Invitrogen | M6494 | |
| NITD008 ≥98% (HPLC) | Sigma-Aldrich | SML2409 | 5 mg |
| qPCR system Mx3000P | Agilent | ||
| Renilla luciferase Assay System | PROMEGA | E2810 | |
| SpectraMax Gemini EM Fluorescence Reader | Molecular Devices | ||
| SpectraMax i3 Multi-Mode Detection Platform | Molecular Devices | ||
| SpectraMax Plus 384 Absorbance Microplate Reader | Molecular Devices | ||
| SYBR Green I | Invitrogen | S7563 | 500 µl |
| Triton X-100 | SIGMA-Aldrich | X100 | 500 mL |
| Trizma base | SIGMA-Aldrich | T1503 | 1 kg |
| Trypsin-EDTA Solution 1X | SIGMA-Aldrich | 59417-C | 100 mL |
Referencias
- Zou, J., Shi, P. Y. Strategies for Zika drug discovery. Current Opinion in Virology. 35, 19-26 (2019).
- Cugola, F. R., et al. The Brazilian Zika virus strain causes birth defects in experimental models. Nature. 534 (7606), 267-271 (2016).
- de Araújo, T. V. B., et al. Association between microcephaly, Zika virus infection, and other risk factors in Brazil: Final report of a case-control study. The Lancet Infectious Diseases. 18 (3), 328-336 (2018).
- Cao-Lormeau, V. -. M., et al. Guillain-Barré Syndrome outbreak associated with Zika virus infection in French Polynesia: a case-control study. The Lancet. 387 (10027), 1531-1539 (2016).
- Pielnaa, P., et al. Zika virus-spread, epidemiology, genome, transmission cycle, clinical manifestation, associated challenges, vaccine and antiviral drug development. Virology. 543, 34-42 (2020).
- Bollati, M., et al. Structure and functionality in flavivirus NS-proteins: Perspectives for drug design Flaviviral NS3 protein Flaviviral NS5 protein Protease Helicase Polymerase Methyltransferase Flavivirus protein structure Antivirals VIZIER Consortium. Antiviral Research. 87, 125-148 (2010).
- Fernandes, R. S., et al. Reporter replicons for antiviral drug discovery against positive single-stranded RNA viruses. Viruses. 12 (6), (2020).
- Fernandes, R. S., et al. Discovery of an imidazonaphthyridine and a riminophenazine as potent anti-Zika virus agents through a replicon-based high-throughput screening. Virus Research. 299, 198388 (2021).
- Noske, G. D., et al. Structural characterization and polymorphism analysis of the NS2B-NS3 protease from the 2017 Brazilian circulating strain of Yellow Fever virus. Biochimica et Biophysica Acta – General Subjects. 1864 (4), 129521 (2020).
- Godoy, A. S., et al. Crystal structure of Zika virus NS5 RNA-dependent RNA polymerase. Nature Communications. 8, 14764 (2017).
- Yin, Z., et al. An adenosine nucleoside inhibitor of dengue virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (48), 20435-20439 (2009).
- Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Brecher, M., Zhang, J., Li, H. The flavivirus protease as a target for drug discovery. Virologica Sinica. 28 (6), 326-336 (2013).
- Noble, C. G., Seh, C. C., Chao, A. T., Shi, P. Y. Ligand-bound structures of the dengue virus protease reveal the active conformation. Journal of Virology. 86 (1), 438-446 (2012).
- Chen, X., et al. Mechanisms of activation and inhibition of Zika virus NS2B-NS3 protease. Cell Research. 26 (11), 1260-1263 (2016).
- Eyer, L., Nencka, R., de Clercq, E., Seley-Radtke, K., Růžek, D. Nucleoside analogs as a rich source of antiviral agents active against arthropod-borne flaviviruses. Antiviral Chemistry and Chemotherapy. 26, (2018).
- Xie, X., et al. Zika Virus Replicons for Drug Discovery. EBioMedicine. 12, 156-160 (2016).
- Pan, K. L., Lee, J. C., Sung, H. W., Chang, T. Y., Hsu, J. T. A. Development of NS3/4A protease-based reporter assay suitable for efficiently assessing hepatitis C virus infection. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (11), 4825-4834 (2009).
- Khumthong, R., Angsuthanasombat, C., Panyim, S., Katzenmeier, G. In Vitro Determination of Dengue Virus Type 2 NS2B-NS3 Protease Activity with Fluorescent Peptide Substrates. Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 35 (2), (2002).
- Ulanday, G. E. L., Okamoto, K., Morita, K. Development and utility of an in vitro, fluorescence-based assay for the discovery of novel compounds against dengue 2 viral protease. Tropical Medicine and Health. 44 (1), 1-10 (2016).
- Ong, I. L. H., Yang, K. L. Recent developments in protease activity assays and sensors. Analyst. 142 (11), 1867-1881 (2017).
- Eltahla, A. A., Lackovic, K., Marquis, C., Eden, J. S., White, P. A. A fluorescence-based high-throughput screen to identify small compound inhibitors of the genotype 3a hepatitis c virus RNA polymerase. Journal of Biomolecular Screening. 18 (9), 1027-1034 (2013).
- Eydoux, C., et al. A fluorescence-based high throughput-screening assay for the SARS-CoV RNA synthesis complex. Journal of Virological Methods. 288, 114013 (2021).
- Shimizu, H., et al. Discovery of a small molecule inhibitor targeting dengue virus NS5 RNA-dependent RNA polymerase. PLoS Neglected Tropical Diseases. 13 (11), 1-21 (2019).
- Sáez-Álvarez, Y., Arias, A., del Águila, C., Agudo, R. Development of a fluorescence-based method for the rapid determination of Zika virus polymerase activity and the screening of antiviral drugs. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).
- Kocabas, F., Turan, R. D., Aslan, G. S. Fluorometric RdRp assay with self-priming RNA. Virus Genes. 50 (3), 498-504 (2015).
- Niyomrattanakit, P., et al. A fluorescence-based alkaline phosphatase-coupled polymerase assay for identification of inhibitors of dengue virus RNA-Dependent RNA polymerase. Journal of Biomolecular Screening. 16 (2), 201-210 (2011).
- Simeonov, A., Davis, M. I. . Interference with Fluorescence and Absorbance Flow Chart Fluorescence Interferences. (Md). , 1-8 (2016).
- Genick, C. C., et al. Applications of biophysics in high- Throughput screening hit validation. Journal of Biomolecular Screening. 19 (5), 707-714 (2014).
- Smith, T. M., et al. Identifying initiation and elongation inhibitors of dengue virus RNA polymerase in a high-throughput lead-finding campaign. Journal of Biomolecular Screening. 20 (1), 153-163 (2015).
- Porecha, R., Herschlag, D. RNA radiolabeling. Methods in enzymology. 530, 255-279 (2013).
