عزل السلف ميغاكاريوسيت الماوس
Summary
تصف هذه الطريقة تنقية التدفق الخلوي ل MEP و MKp من عظام الفخذ والساق وعظام الحوض.
Abstract
خلايا نخاع العظم الضخمة هي خلايا متعددة الأضلاع كبيرة تضمن إنتاج الصفائح الدموية. أنها تنشأ من الخلايا الجذعية الدموية من خلال megakaryopoiesis. المراحل النهائية من هذه العملية معقدة وتنطوي كلاسيكيا على السلف Megakaryocyte-Erythrocyte ثنائي القدرة (MEP) وسلفات Megakaryocyte أحادية القدرة (MKp). هذه المجموعات السكانية تسبق تشكيل الخلايا الضخمة حسنة النية ، وعلى هذا النحو ، يمكن عزلها وتوصيفها تسمح للتحليل قوية وغير متحيزة لتشكيل megakaryocyte. يقدم هذا البروتوكول بالتفصيل الإجراء لجمع الخلايا الدموية من نخاع عظم الفأر ، وإثراء السلف الدموية من خلال الاستنفاد المغناطيسي وأخيرا استراتيجية فرز الخلايا التي تسفر عن مجموعات MEP و MKp شديدة النقاء. أولا، يتم جمع خلايا نخاع العظم من عظم الفخذ، والساق، وأيضا قمة الحرقفي، وهو العظم الذي يحتوي على عدد كبير من السلف الدموية. استخدام عظام قمة الحرقفي يزيد بشكل كبير من إجمالي عدد الخلايا التي تم الحصول عليها لكل فأر، وبالتالي يساهم في استخدام أكثر أخلاقية للحيوانات. تم تحسين استنفاد النسب المغناطيسي باستخدام حبات مغناطيسية 450 نانومتر مما يسمح لفرز الخلايا بكفاءة عالية عن طريق قياس التدفق الخلوي. وأخيرا ، فإن البروتوكول يقدم وضع العلامات وgating استراتيجية لفرز اثنين من السكان السلف megakaryocyte تنقية عالية : MEP (لين—SCA – 1—ج كيت+CD16/32—CD150+CD9خافت)وMKP (لين— SCA – 1—ج كيت+CD16/32—CD150+CD9مشرق ). هذه التقنية سهلة التنفيذ وتوفر ما يكفي من المواد الخلوية لأداء 1) التوصيف الجزيئي لمعرفة أعمق لهويتها وبيولوجيتها ، 2) في اختبارات التمايز المختبري ، من شأنها أن توفر فهما أفضل لآليات نضوج الخلايا العملاقة ، أو 3) في نماذج المختبر للتفاعل مع بيئتها الدقيقة.
Introduction
يتم إنتاج الصفائح الدموية بواسطة الخلايا العملاقة. وتقع هذه الخلايا الكبيرة متعددة الأضلاع في نخاع العظام وبالنسبة لجميع خلايا الدم فهي مشتقة من الخلايا الجذعية الدموية (HSC)1. المسار الكلاسيكي لإنتاج megakaryocytes في نخاع العظام ينبع من HSC وينطوي على جيل من السلف المختلفة التي تقيد تدريجيا إمكاناتها التمايز2. أول سلف التوقيع على الالتزام النسب megakaryocytic هو Megakaryocyte-Erythrocyte السلف (MEP)، سلف ثنائي القدرة قادرة على إنتاج كل من خلايا الغدة الدرقية وmegakaryocytes3،4،5. ثم تنتج وزارة التربية والميكارسين سلف وحيد القدرة / السلائف (MKp) التي سوف تفرق إلى megakaryocyte ناضجة قادرة على إنتاج الصفائح الدموية. الآليات التي ينطوي عليها توليد هؤلاء السلف ، فضلا عن تمايزها ونضوجها في الخلايا العملاقة معقدة ومفهومة جزئيا فقط. وبالإضافة إلى ذلك، فإن عدم تجانس السكان MEP من حيث إمكانات التمايز ومستوى الالتزام الجوهري لهذه الخلايا لا تزال غير واضحة. ولفك رموز هذه العمليات، من الضروري الحصول على (أو الوصول إلى) مجموعات منقى من MEP و MKp لإجراء تحليلات جزيئية وخلايا واحدة دقيقة.
وقد أظهرت العديد من الدراسات مجموعات معينة من علامات سطح الخلية لتحديد السلف ملتزمة النسب megakaryocytic في الماوس6،7،8. من هذه تم ابتكار طريقة تسمح لتنقية MEP و MKp من الفئران. تم تحسين هذه الطريقة للحصول على خلايا في عدد كاف ونوعية لعدد كبير من المقايسات. مع الاعتبارات الأخلاقية في الاعتبار، ومن أجل تقليل عدد الحيوانات المشاركة في التجارب، ونحن استحثت لحصاد نخاع العظم من عظم الفخذ والساق، وأيضا من قمة الحرقفي. يحتوي هذا العظم على تردد عال وعدد من السلف الدموية ومعظم الوقت معطوب أثناء حصاد العظام الطويل. هنا هو طريقة مفصلة لجمع موثوق بها من هذه العظام.
المعيار الثاني للتحسين هو إنتاج مجموعات خلايا عالية النقاء. الفلورسنت تنشيط فرز الخلية (FACS) هو وسيلة للاختيار من أجل الحصول على السكان تنقية من الخلايا ذات الاهتمام. ومع ذلك، يتم الوصول إلى غلة منخفضة عندما يكون السكان الخلية من الفائدة نادرة جدا. ولذلك فإن إجراءات الإثراء ضرورية. في هذا البروتوكول، تم اختيار إجراء اختيار سلبي باستخدام الخرز المغناطيسي.
Protocol
Representative Results
Discussion
الطريقة الموصوفة في هذه الورقة يسمح لاستخراج وتنقية الماوس MEP و MKp. وكان من السمات الهامة في تحسين البروتوكول الحصول على عدد كاف من الخلايا التي من شأنها أن تكون متوافقة مع معظم المقايسات الجزيئية والخلوية. عادة ما تتكون الممارسة العامة لجمع عظام الفأر لاستخراج الخلايا المكونة للدم في حصا?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفون أن يشكروا مونيك فرويند وكاثرين زيسيل وكيتي على المساعدة التقنية. وقد دعم هذا العمل الرابطة العامة لمناهضة الانتخابات ومنظمة أطباء بلا حدود، وغرانت ANR-17-CE14-0001-01 إلى Henri.de la. سال.
Materials
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| 7AAD | Sigma-Aldrich | A9400 | |
| Antibody Gr-1-biotin | eBioscience | 13-5931-85 | Magnetic depletion |
| Antibody B220-biotin | eBioscience | 13-0452-85 | Magnetic depletion |
| Antibody Mac-1-biotin | eBioscience | 13-0112-85 | Magnetic depletion |
| Antibody CD3e-biotin | eBioscience | 13-0031-85 | Magnetic depletion |
| Antibody CD4-biotin | eBioscience | 13-9766-82 | Magnetic depletion |
| Antibody CD5-biotin | eBioscience | 13-0051-85 | Magnetic depletion |
| Antibody CD8a-biotin | eBioscience | 13-0081-85 | Magnetic depletion |
| Antibody TER119-biotin | eBioscience | 13-5921-85 | Magnetic depletion |
| Antibody CD127-biotin | eBioscience | 13-1271-85 | Magnetic depletion |
| Antibody CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-85 | Cell sorting |
| Antibody CD45-PE | eBioscience | 12-0451-83 | Cell sorting |
| Antibody TER119-APC | eBioscience | 17-5921-83 | Cell sorting |
| Antibody CD45-PECy7 | eBioscience | 25-0451-82 | Cell sorting |
| Antibody CD45-biotin | eBioscience | 13-0451-85 | Cell sorting |
| Antibody CD9-FITC | eBioscience | 11-0091-82 | Cell sorting |
| Antibody c-kit-APC | eBioscience | 17-1171-83 | Cell sorting |
| Antibody Sca-1-PE | eBioscience | 12-5981-83 | Cell sorting |
| Antibody CD16/32-PE | eBioscience | 12-0161-83 | Cell sorting |
| Antibody CD150-PECy7 | eBioscience | 25-1502-82 | Cell sorting |
| Culture medium StemSpan-SFEM | Stemcell technologies | #09650 | |
| Dissection pad | Fisher Scientific | 10452395 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | |
| Ethanol | vWR Chemicals | 83813.360 | |
| Forceps | Euronexia | P-120-AS | |
| Glass pasteur pipette | Dutscher | 42011 | |
| Magnet : DynaMag-5 | Thermo Fisher Scientific | 12303D | |
| Magnetic beads: Dynabeads Sheep Anti-Rat IgG | Thermo Fisher Scientific | 11035 | |
| Megacult | Stemcell technologies | #04970 | |
| MethoCult SF M3436 | Stemcell technologies | #03436 | |
| Newborn Calf Serum | Dutscher | 50750-500 | |
| Red Cell Lysis solution | BD Bioscience | 555899 | |
| Scalpels | Fisher Scientific | 12308009 | |
| Scissors | Euronexia | C-165-ASB | |
| Sterile 1 mL syringes | BD Bioscience | 303172 | |
| Sterile 15mL tubes | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Sterile 5mL polypropylene tubes | Falcon | 352063 | |
| Sterile 5mL polystyrene tubes | Falcon | 352054 | |
| Sterile tubes with 70µm cell strainer cap | Falcon | 352235 | |
| Sterile petri dish | Falcon | 353003 | |
| Streptavidin-APC-Cy7 | BD Biosciences | 554063 | Cell sorting |
| Tube roller | Benchmark Scientific | R3005 |
Referencias
- Kaushansky, K. Historical review: megakaryopoiesis and thrombopoiesis. Blood. 111 (3), 981-986 (2008).
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).
- Debili, N., et al. Characterization of a bipotent erythro-megakaryocytic progenitor in human bone marrow. Blood. 88 (4), 1284-1296 (1996).
- Forsberg, E. C., Serwold, T., Kogan, S., Weissman, I. L., Passegué, E. New evidence supporting megakaryocyte-erythrocyte potential of flk2/flt3+ multipotent hematopoietic progenitors. Cell. 126 (2), 415-426 (2006).
- Vannucchi, A. M., et al. Identification and characterization of a bipotent (erythroid and megakaryocytic) cell precursor from the spleen of phenylhydrazine-treated mice. Blood. 95 (8), 2559-2568 (2000).
- Pronk, C. J., et al. Elucidation of the phenotypic, functional, and molecular topography of a myeloerythroid progenitor cell hierarchy. Cell Stem Cell. 1 (4), 428-442 (2007).
- Nakorn, T. N., Miyamoto, T., Weissman, I. L. Characterization of mouse clonogenic megakaryocyte progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (1), 205-210 (2003).
- Ng, A. P., et al. Characterization of thrombopoietin (TPO)-responsive progenitor cells in adult mouse bone marrow with in vivo megakaryocyte and erythroid potential. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2364-2369 (2012).
- Strassel, C., et al. Hirudin and heparin enable efficient megakaryocyte differentiation of mouse bone marrow progenitors. Experimental Cell Research. 318 (1), 25-32 (2012).
- Brouard, N., et al. A unique microenvironment in the developing liver supports the expansion of megakaryocyte progenitors. Blood Advances. 1 (21), 1854-1866 (2017).
- Boscher, J., Gachet, C., Lanza, F., Léon, C. Megakaryocyte culture in 3D methylcellulose-based hydrogel to improve cell maturation and study the impact of stiffness and confinement. Journal of Visualized Experiments:JOVE. , (2021).
- Sanjuan-Pla, A., et al. Platelet-biased stem cells reside at the apex of the haematopoietic stem-cell hierarchy. Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).
- Haas, S., et al. Inflammation-driven fast-track differentiation of HSCs into the megakaryocytic lineage. Experimental Hematology. 42 (8), 14 (2014).
- Shin, J. Y., Hu, W., Naramura, M., Park, C. Y. High c-Kit expression identifies hematopoietic stem cells with impaired self-renewal and megakaryocytic bias. The Journal of Experimental Medicine. 211 (2), 217-231 (2014).
