マウスメガ核球前駆細胞の分離
Summary
この方法は、マウス大腿骨、脛骨、および骨盤骨からのMEPおよびMKpのフローサイトメトリーによる精製を記述する。
Abstract
骨髄巨核球は血小板の産生を保障する大きい多倍化細胞である。彼らは、造血幹細胞から巨核代を介して生じる。このプロセスの最終段階は複雑で古典的に二能性の巨核球-赤血球前駆細胞(MEP)と単一の巨大核球前駆細胞(MKp)を含む。これらの集団は、ボナフィデス巨核球の形成に先行し、そのように、その分離と特徴付けは、巨核球形成の堅牢で公平な分析を可能にする可能性がある。このプロトコルは、マウス骨髄から造血細胞を収集する手順、磁気枯渇を介した造血前駆物質の濃縮、そして最後に高度に精製されたMEPおよびMKp集団をもたらす細胞選別戦略を提示する。まず、骨髄細胞は大腿骨、脛骨、および腸骨紋から採取され、また、造血前駆腫の数が多い骨である。腸骨の骨の使用は、マウスごとに得られる総細胞数を大幅に増加させ、したがって、動物のより倫理的な使用に貢献する。450 nmの磁気ビーズを使用して磁気系統の枯渇を最適化し、フローサイトメトリーによる非常に効率的な細胞選別を可能にしました。最後に、このプロトコルは、MEP(Lin – Sca-1–c-Kit + CD16/32–CD150+CD9薄暗い)とMKp(Lin – Sca-1–c-kit + CD16/32 – CD150 + CD99)の選別のためのラベリングと格子戦略を提示します。).この技術は実装が容易で、i)分子特性評価を行うのに十分な細胞材料を提供し、そのアイデンティティと生物学のより深い知識、ii)インビトロ分化アッセイは、巨大核球の成熟のメカニズムのより良い理解を提供する、またはiii)彼らの微小環境との相互作用のインビトロモデルをより良く理解する。
Introduction
血小板は巨核球によって産生される。これらの大きな多倍細胞は骨髄に位置し、すべての血液細胞については造血幹細胞(HSC)1に由来する。骨髄における巨核球の産生の古典的な経路はHSCに由来し、それらの分化電位を徐々に制限する異なる前駆物質の生成を伴う2。巨核細胞性系統へのコミットメントに署名する最初の前駆子は、巨核球赤血球前駆細胞(MEP)であり、赤血球細胞と巨核球3、4、5の両方を産生することができる二能性前駆細胞である。その後、MEPは血小板を産生できる成熟した巨核球に分化する一能性前駆細胞/前駆体(MKp)を産生する。これらの前駆体の生成に関与するメカニズムは、巨大核球への分化および成熟と同様に複雑であり、部分的にしか理解されていない。また、分化ポテンシャルとこれらの細胞の本質的なコミットメントレベルの観点からMEP集団の不均一性は依然として不明である。これらのプロセスを解読するには、微細な分子および単一細胞解析のために、MEPおよびMKpの精製された集団を得る(またはアクセス権を持つ)必要があります。
いくつかの研究は、マウス6、7、8の巨核球系にコミットされた前駆体の同定のための細胞表面マーカーの特定の組み合わせを実証している。これらの方法からマウスからのMEPおよびMKpの精製を可能にする方法が考案された。この方法は、多数のアッセイに対して十分な数および品質の細胞を得るために最適化された。倫理的な配慮を念頭に置き、実験に関与する動物の数を最小限に抑えるために、大腿骨や脛骨から骨髄を収穫し、また腸骨の紋章から骨髄を収穫することを引き出しました。この骨は高周波と造血前駆物質の数を含み、長い骨採取中に損傷を受けるほとんどの時間です。ここで提示すると、この骨の信頼性の高いコレクションのための詳細な方法です。
最適化の第2の基準は、高度に精製された細胞集団を生成することです。蛍光活性化細胞選別(FACS)は、目的の細胞の精製集団を得るために選択する方法である。しかし、関心のある細胞集団が非常にまれである場合、低収量に達する。したがって、エンリッチメント手順が必要です。このプロトコルでは、磁気ビーズを使用して負の選択手順を選択しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
本論文では、マウスMEPやMKpの抽出と精製が可能です。プロトコルの最適化における重要なパラメータは、ほとんどの分子および細胞ベースのアッセイと互換性のある十分な数の細胞を得ることだった。造血細胞抽出のためのマウス骨採取の一般的な実践は、通常、各マウスの大腿骨および脛骨の両方を収穫することにある。造血材料のもう一つの供給源である骨盤骨は、見落とされがちであ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、モニーク・フロイント、キャサリン・ジーゼル、ケティの技術支援に感謝したいと考えています。この作品は、ARMESA(メデシン・エ・サンテ・パブリケ協会)とグラントANR-17-CE14-0001-01によって Henri.de ラによって支えられました。サル。
Materials
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| 7AAD | Sigma-Aldrich | A9400 | |
| Antibody Gr-1-biotin | eBioscience | 13-5931-85 | Magnetic depletion |
| Antibody B220-biotin | eBioscience | 13-0452-85 | Magnetic depletion |
| Antibody Mac-1-biotin | eBioscience | 13-0112-85 | Magnetic depletion |
| Antibody CD3e-biotin | eBioscience | 13-0031-85 | Magnetic depletion |
| Antibody CD4-biotin | eBioscience | 13-9766-82 | Magnetic depletion |
| Antibody CD5-biotin | eBioscience | 13-0051-85 | Magnetic depletion |
| Antibody CD8a-biotin | eBioscience | 13-0081-85 | Magnetic depletion |
| Antibody TER119-biotin | eBioscience | 13-5921-85 | Magnetic depletion |
| Antibody CD127-biotin | eBioscience | 13-1271-85 | Magnetic depletion |
| Antibody CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-85 | Cell sorting |
| Antibody CD45-PE | eBioscience | 12-0451-83 | Cell sorting |
| Antibody TER119-APC | eBioscience | 17-5921-83 | Cell sorting |
| Antibody CD45-PECy7 | eBioscience | 25-0451-82 | Cell sorting |
| Antibody CD45-biotin | eBioscience | 13-0451-85 | Cell sorting |
| Antibody CD9-FITC | eBioscience | 11-0091-82 | Cell sorting |
| Antibody c-kit-APC | eBioscience | 17-1171-83 | Cell sorting |
| Antibody Sca-1-PE | eBioscience | 12-5981-83 | Cell sorting |
| Antibody CD16/32-PE | eBioscience | 12-0161-83 | Cell sorting |
| Antibody CD150-PECy7 | eBioscience | 25-1502-82 | Cell sorting |
| Culture medium StemSpan-SFEM | Stemcell technologies | #09650 | |
| Dissection pad | Fisher Scientific | 10452395 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | |
| Ethanol | vWR Chemicals | 83813.360 | |
| Forceps | Euronexia | P-120-AS | |
| Glass pasteur pipette | Dutscher | 42011 | |
| Magnet : DynaMag-5 | Thermo Fisher Scientific | 12303D | |
| Magnetic beads: Dynabeads Sheep Anti-Rat IgG | Thermo Fisher Scientific | 11035 | |
| Megacult | Stemcell technologies | #04970 | |
| MethoCult SF M3436 | Stemcell technologies | #03436 | |
| Newborn Calf Serum | Dutscher | 50750-500 | |
| Red Cell Lysis solution | BD Bioscience | 555899 | |
| Scalpels | Fisher Scientific | 12308009 | |
| Scissors | Euronexia | C-165-ASB | |
| Sterile 1 mL syringes | BD Bioscience | 303172 | |
| Sterile 15mL tubes | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Sterile 5mL polypropylene tubes | Falcon | 352063 | |
| Sterile 5mL polystyrene tubes | Falcon | 352054 | |
| Sterile tubes with 70µm cell strainer cap | Falcon | 352235 | |
| Sterile petri dish | Falcon | 353003 | |
| Streptavidin-APC-Cy7 | BD Biosciences | 554063 | Cell sorting |
| Tube roller | Benchmark Scientific | R3005 |
Referencias
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