Выделение прародителей мегакариоцитов мыши
Summary
Этот метод описывает очистку с помощью проточной цитометрии MEP и MKp от бедренных костей, большеберцовой кости и костей таза мышей.
Abstract
Мегакариоциты костного мозга представляют собой крупные полиплоидные клетки, обеспечивающие выработку тромбоцитов крови. Они возникают из гемопоэтических стволовых клеток через мегакариопоэз. Заключительные этапы этого процесса сложны и классически включают бипотентные мегакариоцитарно-эритроцитарные прародители (MEP) и унипотентные мегакариоцитарные прародители (MKp). Эти популяции предшествуют образованию настоящих мегакариоцитов, и, как таковые, их выделение и характеристика могут позволить провести надежный и непредвзятый анализ образования мегакариоцитов. В этом протоколе подробно представлена процедура сбора кроветворных клеток из костного мозга мыши, обогащение гемопоэтических прародителей путем магнитного истощения и, наконец, стратегия сортировки клеток, которая дает высокоочищенные популяции MEP и MKp. Во-первых, клетки костного мозга собираются из бедренной кости, большеберцовой кости, а также подвздошного гребня, кости, которая содержит большое количество кроветворных прародителей. Использование костей подвздошного гребня резко увеличивает общее количество клеток, получаемых на мышь, и, таким образом, способствует более этичному использованию животных. Истощение магнитной линии было оптимизировано с использованием магнитных шариков 450 нм, что позволило очень эффективно сортировать ячейки с помощью проточной цитометрии. Наконец, в протоколе представлена стратегия маркировки и сортировки двух высокоочищеных популяций-прародителя мегакариоцитов: MEP (Lin–Sca-1–c-Kit+CD16/32–CD150+CD9dim)и MKp (Lin– Sca-1–c-Kit+CD16/32–CD150+CD9bright ). Этот метод прост в реализации и обеспечивает достаточно клеточного материала для выполнения i) молекулярной характеристики для более глубокого знания их идентичности и биологии, ii) анализов дифференцировки in vitro, которые обеспечат лучшее понимание механизмов созревания мегакариоцитов, или iii) in vitro моделей взаимодействия с их микросредой.
Introduction
Тромбоциты крови вырабатываются мегакариоцитами. Эти крупные полиплоидные клетки расположены в костном мозге и, как и все клетки крови, получены из гемопоэтических стволовых клеток (HSC)1. Классический путь производства мегакариоцитов в костном мозге берет свое начало от ГСК и предполагает генерацию различных прародителей, которые постепенно ограничивают их дифференцировальный потенциал2. Первым прародителем, подписавшим обязательство по мегакариоцитарной линии, является мегакариоцит-эритроцитарный прародитель (MEP), бипотентный прародитель, способный продуцировать как эритроидныеклетки,так и мегакариоциты3,4,5. Затем MEP производит унипотентный предшественник / предшественник (MKp), который будет дифференцироваться в зрелый мегакариоцит, способный продуцировать тромбоциты. Механизмы, участвующие в генерации этих прародителей, а также их дифференцировка и созревание в мегакариоциты сложны и понятны лишь частично. Кроме того, гетерогенность популяции MEP с точки зрения потенциала дифференцировки и внутреннего уровня приверженности этих клеток все еще неясна. Чтобы расшифровать эти процессы, важно получить (или иметь доступ) очищенные популяции MEP и MKp для тонкомолекулярного и одноклеточного анализа.
Несколько исследований продемонстрировали особые комбинации маркеров клеточной поверхности для идентификации прародителей, приверженных мегакариоцитарной линии у мышей6,7,8. Из них был разработан метод, позволяющий очищать MEP и MKp от мышей. Этот метод был оптимизирован для получения клеток в достаточном количестве и качестве для большого количества анализов. С учетом этических соображений и для того, чтобы свести к минимуму количество животных, участвующих в экспериментах, мы собрали костный мозг из бедренной и большеберцовой костей, а также из подвздошного гребня. Эта кость содержит высокую частоту и количество кроветворных прародителей и большую часть времени повреждается во время длительного сбора костной ткани. Здесь представлен подробный метод надежного сбора этой кости.
Вторым критерием оптимизации является создание высокоочищеных клеточных популяций. Флуоресцентная активированная сортировка клеток (FACS) является методом выбора для получения очищенных популяций интересующих клеток. Тем не менее, низкие урожаи достигаются, когда интересуемая популяция клеток очень редка. Таким образом, необходимы процедуры обогащения. В этом протоколе была выбрана процедура отрицательного отбора с использованием магнитных шариков.
Protocol
Representative Results
Discussion
Способ, описанный в данной работе, позволяет экстракцию и очистку мышиных MEP и MKp. Важным параметром в оптимизации протокола было получение достаточного количества клеток, которые были бы совместимы с большинством молекулярных и клеточных анализов. Общая практика сбора костной ткани м?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Моник Фройнд, Катрин Циссель и Кетти за техническую помощь. Эта работа была поддержана ARMESA (Ассоциация исследований и развития в области медицины и санте publique) и грантом ANR-17-CE14-0001-01 для Henri.de la. Саль.
Materials
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| 7AAD | Sigma-Aldrich | A9400 | |
| Antibody Gr-1-biotin | eBioscience | 13-5931-85 | Magnetic depletion |
| Antibody B220-biotin | eBioscience | 13-0452-85 | Magnetic depletion |
| Antibody Mac-1-biotin | eBioscience | 13-0112-85 | Magnetic depletion |
| Antibody CD3e-biotin | eBioscience | 13-0031-85 | Magnetic depletion |
| Antibody CD4-biotin | eBioscience | 13-9766-82 | Magnetic depletion |
| Antibody CD5-biotin | eBioscience | 13-0051-85 | Magnetic depletion |
| Antibody CD8a-biotin | eBioscience | 13-0081-85 | Magnetic depletion |
| Antibody TER119-biotin | eBioscience | 13-5921-85 | Magnetic depletion |
| Antibody CD127-biotin | eBioscience | 13-1271-85 | Magnetic depletion |
| Antibody CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-85 | Cell sorting |
| Antibody CD45-PE | eBioscience | 12-0451-83 | Cell sorting |
| Antibody TER119-APC | eBioscience | 17-5921-83 | Cell sorting |
| Antibody CD45-PECy7 | eBioscience | 25-0451-82 | Cell sorting |
| Antibody CD45-biotin | eBioscience | 13-0451-85 | Cell sorting |
| Antibody CD9-FITC | eBioscience | 11-0091-82 | Cell sorting |
| Antibody c-kit-APC | eBioscience | 17-1171-83 | Cell sorting |
| Antibody Sca-1-PE | eBioscience | 12-5981-83 | Cell sorting |
| Antibody CD16/32-PE | eBioscience | 12-0161-83 | Cell sorting |
| Antibody CD150-PECy7 | eBioscience | 25-1502-82 | Cell sorting |
| Culture medium StemSpan-SFEM | Stemcell technologies | #09650 | |
| Dissection pad | Fisher Scientific | 10452395 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | |
| Ethanol | vWR Chemicals | 83813.360 | |
| Forceps | Euronexia | P-120-AS | |
| Glass pasteur pipette | Dutscher | 42011 | |
| Magnet : DynaMag-5 | Thermo Fisher Scientific | 12303D | |
| Magnetic beads: Dynabeads Sheep Anti-Rat IgG | Thermo Fisher Scientific | 11035 | |
| Megacult | Stemcell technologies | #04970 | |
| MethoCult SF M3436 | Stemcell technologies | #03436 | |
| Newborn Calf Serum | Dutscher | 50750-500 | |
| Red Cell Lysis solution | BD Bioscience | 555899 | |
| Scalpels | Fisher Scientific | 12308009 | |
| Scissors | Euronexia | C-165-ASB | |
| Sterile 1 mL syringes | BD Bioscience | 303172 | |
| Sterile 15mL tubes | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Sterile 5mL polypropylene tubes | Falcon | 352063 | |
| Sterile 5mL polystyrene tubes | Falcon | 352054 | |
| Sterile tubes with 70µm cell strainer cap | Falcon | 352235 | |
| Sterile petri dish | Falcon | 353003 | |
| Streptavidin-APC-Cy7 | BD Biosciences | 554063 | Cell sorting |
| Tube roller | Benchmark Scientific | R3005 |
Referencias
- Kaushansky, K. Historical review: megakaryopoiesis and thrombopoiesis. Blood. 111 (3), 981-986 (2008).
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).
- Debili, N., et al. Characterization of a bipotent erythro-megakaryocytic progenitor in human bone marrow. Blood. 88 (4), 1284-1296 (1996).
- Forsberg, E. C., Serwold, T., Kogan, S., Weissman, I. L., Passegué, E. New evidence supporting megakaryocyte-erythrocyte potential of flk2/flt3+ multipotent hematopoietic progenitors. Cell. 126 (2), 415-426 (2006).
- Vannucchi, A. M., et al. Identification and characterization of a bipotent (erythroid and megakaryocytic) cell precursor from the spleen of phenylhydrazine-treated mice. Blood. 95 (8), 2559-2568 (2000).
- Pronk, C. J., et al. Elucidation of the phenotypic, functional, and molecular topography of a myeloerythroid progenitor cell hierarchy. Cell Stem Cell. 1 (4), 428-442 (2007).
- Nakorn, T. N., Miyamoto, T., Weissman, I. L. Characterization of mouse clonogenic megakaryocyte progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (1), 205-210 (2003).
- Ng, A. P., et al. Characterization of thrombopoietin (TPO)-responsive progenitor cells in adult mouse bone marrow with in vivo megakaryocyte and erythroid potential. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2364-2369 (2012).
- Strassel, C., et al. Hirudin and heparin enable efficient megakaryocyte differentiation of mouse bone marrow progenitors. Experimental Cell Research. 318 (1), 25-32 (2012).
- Brouard, N., et al. A unique microenvironment in the developing liver supports the expansion of megakaryocyte progenitors. Blood Advances. 1 (21), 1854-1866 (2017).
- Boscher, J., Gachet, C., Lanza, F., Léon, C. Megakaryocyte culture in 3D methylcellulose-based hydrogel to improve cell maturation and study the impact of stiffness and confinement. Journal of Visualized Experiments:JOVE. , (2021).
- Sanjuan-Pla, A., et al. Platelet-biased stem cells reside at the apex of the haematopoietic stem-cell hierarchy. Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).
- Haas, S., et al. Inflammation-driven fast-track differentiation of HSCs into the megakaryocytic lineage. Experimental Hematology. 42 (8), 14 (2014).
- Shin, J. Y., Hu, W., Naramura, M., Park, C. Y. High c-Kit expression identifies hematopoietic stem cells with impaired self-renewal and megakaryocytic bias. The Journal of Experimental Medicine. 211 (2), 217-231 (2014).
