Isolamento de Progenitores de Megacaiócitos de Rato
Summary
Este método descreve a purificação por citometria de fluxo de MEP e MKp de fêmures, tíbias e ossos pélvicos.
Abstract
Megacariócitos de medula óssea são grandes células poliploides que garantem a produção de plaquetas sanguíneas. Elas surgem de células-tronco hematopoiéticas através de megacaripoiesis. As etapas finais deste processo são complexas e classicamente envolvem os progenitores megacariócitos bipotentes -Eritrócitos (MEP) e os progenitores megacayócitos unipotentes (MKp). Essas populações precedem a formação de megacaiócitos de boa fé e, como tal, seu isolamento e caracterização poderiam permitir a análise robusta e imparcial da formação de megacaiócitos. Este protocolo apresenta em detalhes o procedimento para coletar células hematopoiéticas da medula óssea do rato, o enriquecimento de progenitores hematopoiéticos através do esgotamento magnético e, finalmente, uma estratégia de classificação celular que produz populações altamente purificadas de MEP e MKp. Primeiro, as células de medula óssea são coletadas do fêmur, da tíbia, e também da crista ilíaca, um osso que contém um alto número de progenitores hematopoiéticos. O uso de ossos de crista ilíaca aumenta drasticamente o número total de células obtidas por camundongo e, portanto, contribui para um uso mais ético dos animais. Um esgotamento da linhagem magnética foi otimizado usando contas magnéticas de 450 nm permitindo uma classificação celular muito eficiente por citometria de fluxo. Por fim, o protocolo apresenta a estratégia de rotulagem e gating para a classificação das duas populações progenitoras megacarióficas altamente purificadas: MEP (Lin–Sca-1–c-Kit+CD16/32–CD150+CD9dim) e MKp (Lin– Sca-1–c-Kit+CD16/32–CD150+CD9bright ). Esta técnica é fácil de implementar e fornece material celular suficiente para realizar i) caracterização molecular para um conhecimento mais profundo de sua identidade e biologia, ii) ensaios de diferenciação in vitro, que proporcionarão uma melhor compreensão dos mecanismos de maturação de megacaiócitos, ou iii) modelos in vitro de interação com seu microambiente.
Introduction
Plaquetas de sangue são produzidas por megacariócitos. Estas grandes células poliploides estão localizadas na medula óssea e, como em todas as células sanguíneas, elas são derivadas de Células-Tronco Hematopoiéticas (HSC)1. O caminho clássico de produção de megacaiócitos na medula óssea tem origem no HSC e envolve a geração de diferentes progenitores que restringem progressivamente seu potencial de diferenciação2. O primeiro progenitor a assinar o compromisso com a linhagem megacariocítica é o Progenitor megacarito-eritrócito (MEP), um progenitor bipotente capaz de produzir células eritrógradas e megacariócitos3,4,5. O MEP então produz um progenitor/precursor unipotente (MKp) que se diferenciará em um megacaiócito maduro capaz de produzir plaquetas. Os mecanismos envolvidos na geração desses progenitores, bem como sua diferenciação e maturação em megacaitos são complexos e apenas parcialmente compreendidos. Além disso, ainda não está clara a heterogeneidade da população do MEP em termos de potencial de diferenciação e de comprometimento intrínseco dessas células. Para decifrar esses processos, é essencial obter (ou ter acesso) a populações purificadas de MEP e MKp para análises moleculares e celulares únicas.
Vários estudos demonstraram combinações particulares de marcadores de superfície celular para a identificação de progenitores comprometidos com a linhagem megacariocítica no mouse6,7,8. A partir destes, foi elaborado um método que permite a purificação de MEP e MKp de camundongos. Este método foi otimizado para a obtenção de células em número e qualidade adequados para um grande número de ensaios. Com considerações éticas em mente, e a fim de minimizar o número de animais envolvidos nos experimentos, nós provocamos para colher a medula óssea do fêmur e tíbia, e também da crista ilíaca. Este osso contém uma alta frequência e número de progenitores hematopoiéticos e é a maior parte do tempo danificado durante a longa colheita óssea. Apresentado aqui é um método detalhado para a coleta confiável deste osso.
O segundo critério de otimização é produzir populações celulares altamente purificadas. A Classificação celular ativada fluorescente (FACS) é um método de escolha para obter populações purificadas de células de interesse. No entanto, os baixos rendimentos são alcançados quando a população celular de interesse é muito rara. Assim, são necessários procedimentos de enriquecimento. Neste protocolo, optou-se por um procedimento de seleção negativa usando contas magnéticas.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método descrito neste artigo permite a extração e purificação do mouse MEP e MKp. Um parâmetro importante na otimização do protocolo foi a obtenção de número suficiente de células compatíveis com a maioria dos ensaios moleculares e celulares. A prática geral da coleta de ossos de camundongos para extração de células hematopoiéticas geralmente consiste na colheita dos fêmures e tíbias de cada rato. O osso pélvico, outra fonte de material hematopoiético, é, portanto, muitas vezes negligenciado. As …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem Monique Freund, Catherine Ziessel e Ketty pela assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pela ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), e por Grant ANR-17-CE14-0001-01 a Henri.de la. Salle.
Materials
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| 7AAD | Sigma-Aldrich | A9400 | |
| Antibody Gr-1-biotin | eBioscience | 13-5931-85 | Magnetic depletion |
| Antibody B220-biotin | eBioscience | 13-0452-85 | Magnetic depletion |
| Antibody Mac-1-biotin | eBioscience | 13-0112-85 | Magnetic depletion |
| Antibody CD3e-biotin | eBioscience | 13-0031-85 | Magnetic depletion |
| Antibody CD4-biotin | eBioscience | 13-9766-82 | Magnetic depletion |
| Antibody CD5-biotin | eBioscience | 13-0051-85 | Magnetic depletion |
| Antibody CD8a-biotin | eBioscience | 13-0081-85 | Magnetic depletion |
| Antibody TER119-biotin | eBioscience | 13-5921-85 | Magnetic depletion |
| Antibody CD127-biotin | eBioscience | 13-1271-85 | Magnetic depletion |
| Antibody CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-85 | Cell sorting |
| Antibody CD45-PE | eBioscience | 12-0451-83 | Cell sorting |
| Antibody TER119-APC | eBioscience | 17-5921-83 | Cell sorting |
| Antibody CD45-PECy7 | eBioscience | 25-0451-82 | Cell sorting |
| Antibody CD45-biotin | eBioscience | 13-0451-85 | Cell sorting |
| Antibody CD9-FITC | eBioscience | 11-0091-82 | Cell sorting |
| Antibody c-kit-APC | eBioscience | 17-1171-83 | Cell sorting |
| Antibody Sca-1-PE | eBioscience | 12-5981-83 | Cell sorting |
| Antibody CD16/32-PE | eBioscience | 12-0161-83 | Cell sorting |
| Antibody CD150-PECy7 | eBioscience | 25-1502-82 | Cell sorting |
| Culture medium StemSpan-SFEM | Stemcell technologies | #09650 | |
| Dissection pad | Fisher Scientific | 10452395 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | |
| Ethanol | vWR Chemicals | 83813.360 | |
| Forceps | Euronexia | P-120-AS | |
| Glass pasteur pipette | Dutscher | 42011 | |
| Magnet : DynaMag-5 | Thermo Fisher Scientific | 12303D | |
| Magnetic beads: Dynabeads Sheep Anti-Rat IgG | Thermo Fisher Scientific | 11035 | |
| Megacult | Stemcell technologies | #04970 | |
| MethoCult SF M3436 | Stemcell technologies | #03436 | |
| Newborn Calf Serum | Dutscher | 50750-500 | |
| Red Cell Lysis solution | BD Bioscience | 555899 | |
| Scalpels | Fisher Scientific | 12308009 | |
| Scissors | Euronexia | C-165-ASB | |
| Sterile 1 mL syringes | BD Bioscience | 303172 | |
| Sterile 15mL tubes | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Sterile 5mL polypropylene tubes | Falcon | 352063 | |
| Sterile 5mL polystyrene tubes | Falcon | 352054 | |
| Sterile tubes with 70µm cell strainer cap | Falcon | 352235 | |
| Sterile petri dish | Falcon | 353003 | |
| Streptavidin-APC-Cy7 | BD Biosciences | 554063 | Cell sorting |
| Tube roller | Benchmark Scientific | R3005 |
Referencias
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