Isolamento dei progenitori dei megacariociti di topo
Summary
Questo metodo descrive la purificazione mediante citometria a flusso di MEP e MKp da topi femori, tibie e ossa pelviche.
Abstract
I megacariociti del midollo osseo sono grandi cellule poliploidi che assicurano la produzione di piastrine nel sangue. Derivano da cellule staminali ematopoietiche attraverso la megacariopoiesi. Le fasi finali di questo processo sono complesse e coinvolgono classicamente i progenitori bipotenti megacariociti-eritrociti (MEP) e i progenitori unipotenti dei megacariociti (MKp). Queste popolazioni precedono la formazione di megacariociti in buona fede e, come tali, il loro isolamento e caratterizzazione potrebbero consentire l’analisi robusta e imparziale della formazione di megacariociti. Questo protocollo presenta in dettaglio la procedura per raccogliere cellule ematopoietiche dal midollo osseo di topo, l’arricchimento dei progenitori ematopoietici attraverso l’esaurimento magnetico e infine una strategia di selezione cellulare che produce popolazioni MEP e MKp altamente purificate. In primo luogo, le cellule del midollo osseo vengono raccolte dal femore, dalla tibia e anche dalla cresta iliaca, un osso che contiene un numero elevato di progenitori ematopoietici. L’uso di ossa della cresta iliaca aumenta drasticamente il numero totale di cellule ottenute per topo e contribuisce quindi a un uso più etico degli animali. Un esaurimento del lignaggio magnetico è stato ottimizzato utilizzando perle magnetiche a 450 nm che consentono una selezione cellulare molto efficiente mediante citometria a flusso. Infine, il protocollo presenta la strategia di etichettatura e gating per la cernita delle due popolazioni progenitrici di megacariociti altamente purificate: MEP (Lin–Sca-1–c-Kit+CD16/32–CD150+CD9dim) e MKp (Lin– Sca-1–c-Kit+CD16/32–CD150+CD9bright ). Questa tecnica è facile da implementare e fornisce materiale cellulare sufficiente per eseguire i) caratterizzazione molecolare per una conoscenza più approfondita della loro identità e biologia, ii) saggi di differenziazione in vitro, che forniranno una migliore comprensione dei meccanismi di maturazione dei megacariociti, o iii) modelli in vitro di interazione con il loro microambiente.
Introduction
Le piastrine del sangue sono prodotte dai megacariociti. Queste grandi cellule poliploidi si trovano nel midollo osseo e come per tutte le cellule del sangue sono derivate da cellule staminali ematopoietiche (HSC)1. La via classica di produzione dei megacariociti nel midollo osseo ha origine da HSC e prevede la generazione di diversi progenitori che limitano progressivamente il loro potenziale di differenziazione2. Il primo progenitore che firma l’impegno per la linea megacariocitica è il Megakaryocyte-Erythrocyte Progenitor (MEP), un progenitore bipotente in grado di produrre sia cellule eritroidi che megacariociti3,4,5. Il MEP produce quindi un progenitore/precursore unipotente (MKp) che si differenzierà in un megacariocita maturo in grado di produrre piastrine. I meccanismi coinvolti nella generazione di questi progenitori, così come la loro differenziazione e maturazione in megacariociti sono complessi e solo parzialmente compresi. Inoltre, l’eterogeneità della popolazione MEP in termini di potenziale di differenziazione e il livello di impegno intrinseco di queste cellule non sono ancora chiari. Per decifrare questi processi, è essenziale ottenere (o avere accesso a) popolazioni purificate di MEP e MKp per analisi molecolari fini e monocellulari.
Diversi studi hanno dimostrato particolari combinazioni di marcatori di superficie cellulare per l’identificazione di progenitori impegnati nel lignaggio megacariocitico nel topo6,7,8. Da questi è stato ideato un metodo che consente la purificazione di MEP e MKp dai topi. Questo metodo è stato ottimizzato per ottenere cellule in numero e qualità adeguati per un gran numero di saggi. Con considerazioni etiche in mente, e al fine di ridurre al minimo il numero di animali coinvolti negli esperimenti, abbiamo indotto a raccogliere il midollo osseo dal femore e dalla tibia, e anche dalla cresta iliaca. Questo osso contiene un’alta frequenza e numero di progenitori ematopoietici ed è il più delle volte danneggiato durante la raccolta delle ossa lunghe. Presentato qui è un metodo dettagliato per la raccolta affidabile di questo osso.
Il secondo criterio di ottimizzazione è quello di produrre popolazioni cellulari altamente purificate. Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS) è un metodo di scelta al fine di ottenere popolazioni purificate di cellule di interesse. Tuttavia, i bassi rendimenti vengono raggiunti quando la popolazione cellulare di interesse è molto rara. Sono quindi necessarie procedure di arricchimento. In questo protocollo, è stata optata per una procedura di selezione negativa utilizzando perle magnetiche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo descritto in questo articolo consente l’estrazione e la purificazione di MEP e MKp di topo. Un parametro importante nell’ottimizzazione del protocollo è stato quello di ottenere un numero sufficiente di cellule che sarebbe stato compatibile con la maggior parte dei saggi molecolari e cellulari. La pratica generale della raccolta delle ossa di topo per l’estrazione delle cellule ematopoietiche di solito consiste nella raccolta sia dei femori che delle tibie di ciascun topo. L’osso pelvico, un’altra fonte di mat…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare Monique Freund, Catherine Ziessel e Ketty per l’assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto da ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), e da Grant ANR-17-CE14-0001-01 a Henri.de la. Salle.
Materials
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| 7AAD | Sigma-Aldrich | A9400 | |
| Antibody Gr-1-biotin | eBioscience | 13-5931-85 | Magnetic depletion |
| Antibody B220-biotin | eBioscience | 13-0452-85 | Magnetic depletion |
| Antibody Mac-1-biotin | eBioscience | 13-0112-85 | Magnetic depletion |
| Antibody CD3e-biotin | eBioscience | 13-0031-85 | Magnetic depletion |
| Antibody CD4-biotin | eBioscience | 13-9766-82 | Magnetic depletion |
| Antibody CD5-biotin | eBioscience | 13-0051-85 | Magnetic depletion |
| Antibody CD8a-biotin | eBioscience | 13-0081-85 | Magnetic depletion |
| Antibody TER119-biotin | eBioscience | 13-5921-85 | Magnetic depletion |
| Antibody CD127-biotin | eBioscience | 13-1271-85 | Magnetic depletion |
| Antibody CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-85 | Cell sorting |
| Antibody CD45-PE | eBioscience | 12-0451-83 | Cell sorting |
| Antibody TER119-APC | eBioscience | 17-5921-83 | Cell sorting |
| Antibody CD45-PECy7 | eBioscience | 25-0451-82 | Cell sorting |
| Antibody CD45-biotin | eBioscience | 13-0451-85 | Cell sorting |
| Antibody CD9-FITC | eBioscience | 11-0091-82 | Cell sorting |
| Antibody c-kit-APC | eBioscience | 17-1171-83 | Cell sorting |
| Antibody Sca-1-PE | eBioscience | 12-5981-83 | Cell sorting |
| Antibody CD16/32-PE | eBioscience | 12-0161-83 | Cell sorting |
| Antibody CD150-PECy7 | eBioscience | 25-1502-82 | Cell sorting |
| Culture medium StemSpan-SFEM | Stemcell technologies | #09650 | |
| Dissection pad | Fisher Scientific | 10452395 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | |
| Ethanol | vWR Chemicals | 83813.360 | |
| Forceps | Euronexia | P-120-AS | |
| Glass pasteur pipette | Dutscher | 42011 | |
| Magnet : DynaMag-5 | Thermo Fisher Scientific | 12303D | |
| Magnetic beads: Dynabeads Sheep Anti-Rat IgG | Thermo Fisher Scientific | 11035 | |
| Megacult | Stemcell technologies | #04970 | |
| MethoCult SF M3436 | Stemcell technologies | #03436 | |
| Newborn Calf Serum | Dutscher | 50750-500 | |
| Red Cell Lysis solution | BD Bioscience | 555899 | |
| Scalpels | Fisher Scientific | 12308009 | |
| Scissors | Euronexia | C-165-ASB | |
| Sterile 1 mL syringes | BD Bioscience | 303172 | |
| Sterile 15mL tubes | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Sterile 5mL polypropylene tubes | Falcon | 352063 | |
| Sterile 5mL polystyrene tubes | Falcon | 352054 | |
| Sterile tubes with 70µm cell strainer cap | Falcon | 352235 | |
| Sterile petri dish | Falcon | 353003 | |
| Streptavidin-APC-Cy7 | BD Biosciences | 554063 | Cell sorting |
| Tube roller | Benchmark Scientific | R3005 |
Referencias
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