Congélation manuelle par transfert et par immersion d’échantillons biologiques pour la microscopie électronique cryogénique à particule unique

Summary

Ce manuscrit décrit la méthode de transfert et de plongée pour congeler manuellement des échantillons biologiques pour la microscopie électronique cryogénique à particule unique.

Abstract

L’imagerie d’échantillons biologiques avec des électrons pour la détermination de la structure à haute résolution par microscopie électronique cryogénique à particule unique (cryoEM) nécessite une fine couche de glace vitrée contenant les biomolécules d’intérêt. Malgré les nombreuses avancées technologiques de ces dernières années qui ont propulsé le cryoEM monoparticule à l’avant-garde de la biologie structurale, les méthodes par lesquelles les spécimens sont vitrifiés pour l’imagerie à haute résolution restent souvent l’étape limitante du débit. Bien que de nombreux efforts récents aient fourni des moyens de surmonter les obstacles fréquemment rencontrés lors de la vitrification des échantillons, y compris le développement de nouveaux supports d’échantillons et d’instruments de vitrification innovants, le piston à commande manuelle traditionnelle reste un élément de base dans la communauté cryoEM en raison du faible coût d’achat et de la facilité d’utilisation. Ici, nous fournissons des méthodes détaillées pour l’utilisation d’un dispositif de transfert et de plongeon standard de type guillotine à commande manuelle pour la vitrification d’échantillons biologiques pour l’imagerie à haute résolution par cryoEM à particule unique. En outre, les problèmes fréquemment rencontrés et les recommandations de dépannage lorsqu’une préparation standard ne parvient pas à produire un échantillon approprié sont également décrits.

Introduction

La microscopie électronique cryogénique à particule unique (cryoEM) est une technique structurelle puissante qui peut être utilisée pour résoudre des structures d’échantillons biologiques dynamiques à une résolution quasi atomique1,2,3,4. En effet, les progrès récents dans les technologies de détecteurs ^{d’électrons} directs4,5,6,7,8,9,10, les améliorations des sources d’électrons4,11,12,13,14 et la stabilité des lentilles ^{électromagnétiques15}, associés au développement continu de l’acquisition de données ^16,17 et des progiciels d’analyse18,19 ont permis aux chercheurs de déterminer systématiquement les structures de spécimens bien élevés à une résolution de 3 Å ou mieux4,11,13,14,20,21,22,23 . Malgré ces capacités améliorées d’imagerie et de traitement des données, la préparation de la grille cryoEM reste le principal obstacle à la détermination réussie de la structure à haute résolution et constitue souvent un goulot d’étranglement considérable dans le flux de travail EM24,25,26,27.

CryoEM s’appuie sur l’imagerie d’échantillons biologiques dans des solutions aqueuses qui sont congelées pour former un mince film de glace « semblable à du verre » – un processus connu sous le nom de vitrification – qui préserve l’état biochimique natif. La vitrification d’échantillons biologiques pour cryoEM remonte à plus de 40 ans28,29,30 et de nombreuses techniques et équipements développés pour ce processus reposent sur la méthode de transfert et de plongeon initialement détaillée31,32,33,34,35 , par lequel un petit volume d’échantillon (p. ex., 1 à 5 μL) est appliqué sur une grille EM spécialisée avant que la solution excédentaire ne soit éliminée à l’aide de l’interaction physique de la grille avec du papier buvard. Le moment de ce processus est généralement déterminé empiriquement pour chaque échantillon, car un élément essentiel de la congélation des échantillons est l’épaisseur du film de glace vitré – si la glace est trop épaisse, la qualité de l’imagerie se détériore considérablement en raison de la diffusion accrue du faisceau d’électrons, tandis que la glace trop mince peut restreindre l’orientation des protéines et / ou exclure les particules du centre des trous de feuille de ^grille36 . Cette dépendance à l’épaisseur de glace parfaite pour le cryoEM à particule unique a conduit à un large éventail de techniques et d’équipements capables de congeler des échantillons, notamment la ^{robotique37,38}, la microfluidique42 et les appareils à ultrasons ou de pulvérisation27,39,40,41,42,43,44 . Ces dernières années, certains des dispositifs de préparation d’échantillons les plus populaires reposent sur l’utilisation de la robotique pour la congélation automatisée des échantillons à l’aide de la technique de transfert et de ^plongeon45. Bien que ces dispositifs soient conçus pour créer de manière reproductible une épaisseur de glace appropriée pour l’imagerie, ils restent souvent trop coûteux pour que les laboratoires individuels puissent les acheter et les exploiter et se trouvent généralement dans les installations cryoEM à des taux horaires d’utilisation. Au cours des dernières années, la technique originale de transfert et de plongeon manuel est revenue à une utilisation accrue3,47,48,49,50,51,52. En effet, un dispositif de transfert et de plongeon à commande manuelle peut obtenir des grilles cryoEM de haute qualité à une fraction du coût des homologues robotiques. En outre, le buvard manuel offre également aux utilisateurs un plus grand contrôle sur le buvard, car les chercheurs peuvent ajuster le type de transfert (c.-à-d. le transfert arrière de la grille, le transfert avant de la grille, etc.) et le temps de transfert en fonction de chaque échantillon individuel et des questions de recherche.

Dans cet article, nous fournissons des détails sur la façon de congeler efficacement des échantillons biologiques à l’aide d’un dispositif de vitrification manuelle traditionnelle par transfert et par immersion couplé à une plate-forme dewar conçue sur ^mesure53. Les meilleures pratiques, y compris la préparation du cryogène, la manipulation de la grille, l’application d’échantillons et le buvard, ainsi que les pièges courants et les recommandations sur la façon de surmonter ces obstacles sont fournies. Des conseils sur la façon d’augmenter la reproductibilité de l’épaisseur de la glace entre les préparations de grille et sur la façon de modifier le buvard d’échantillon en fonction du type d’échantillon biologique sont discutés. Compte tenu du faible coût associé à l’achat et à l’utilisation du piston manuel décrit dans ce manuscrit, les laboratoires du monde entier peuvent préparer des échantillons biologiques pour cryoEM de manière rentable et reproductible.

Protocol

1. Préparez l’environnement de plongée manuelle REMARQUE: Temps de fonctionnement estimé: 5-30 minutes Placez le piston manuel dans une chambre froide à 4 °C où un humidificateur peut être co-localisé pour maintenir la pièce à près de 100 % d’humidité relative (HR) (Figure 1A).ATTENTION : Veuillez consulter les lignes directrices de l’institution en matière de santé et de sécurité environnementales pour connaître l’emplacemen…

Representative Results

L’exécution réussie du protocole de transfert et de plongeon décrit ici se traduira par une couche mince et uniforme de glace vitrée qui est exempte de toute glace hexagonale, de contaminants et de grands gradients de glace inutilisable qui peuvent être observés au microscope électronique (Figure 3). Un contact incohérent du papier buvard avec la surface de la grille, le retrait prématuré du papier buvard ou le déplacement du papier buvard pendant le contact avec la grille peuve…

Discussion

La vitrification d’échantillons biologiques pour l’imagerie par microscopie électronique cryogénique à particule unique (cryoEM) reste une étape cruciale pour une détermination réussie de la structure. La méthode manuelle de transfert et de plongée décrite dans ce protocole représente une méthode rentable, fiable et robuste pour congeler rapidement des échantillons biologiques dans de minces films de glace vitrée pour l’imagerie cryoEM. En utilisant les méthodes décrites dans le manuscrit, les cherc…

Materials

4 slot grid storage box	Ted Pella	160-40
14 gauge flat metal dispensing tip	Amazon	B07M7YWWLT
22×22 mm square glass coverslip	Sigma	C9802-1PAK
60 mm glass Petri dish to store grids	Fisher	08-747A
100 mm glass Petri dish to store Whatman paper	Fisher	08-747D
150 mm glass Petri dish to store Whatman paper	Fisher	08-747F
250 mL beaker	Fisher	02-555-25B
Blue styrofoam dewar	Spear Lab	FD-500
Brass ethane vessel	Lasco	17-4075
Clamping tweezers	Ted Pella	38825
Delicate task wipes	Fisher	06-666
Dual-stage regulator with control valve	Airgas	Y12N245D580-AG
Dewer grid base	UCSD
Ethane platform	UCSD
Ethane propane tank	Praxair	ET PR50ZU-G	ethane (50%) : propane (50%) in a high-pressure tank
Ethane tank	Praxair	UN1035	ethane (100%)
Flexible arm task light	Amscope	LED-11CR
Grids (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 mesh)	Electron Microscopy Sciences	Q325AR1.3
Humidifier	Target	719438
Hygrometer	ThermoPro	B01H1R0K68
Lab coat	UCSD
Liquid Nitrogen dewar	Worthington	LD4
Liquid Nitrogen gloves	Fisher	19-059-925
Manual plunger stand (black stand + foot pedal)	UCSD
Mark 5 (plunging platform)	UCSD
Nitrile gloves	VWR	82026-424
P20 pipette	Eppendorf	13-690-029
PCR tubes	Eppendorf	E0030124286
Pipette tips	ibis scientific	63300005
Ring lamp	Amazon	B07HMR4H8G
Safety glasses	UCSD
Scissors	Amazon	Fiskars 01-004761J
Screw driver	Ironside	354711
Tape	Fisher	15-901-10R
Tweezer to transfer grid box	Amazon	LTS-3
Tygon tubing	Fisher	14-171-130
Whatman blotting paper	Fisher	1001-090