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Bioquímica

단일 입자 극저온 전자 현미경 검사법을 위한 생물학적 표본의 수동 블롯 및 플런지 동결

Published: February 07, 2022
doi:
10.3791/62765
, , ,
1Department of Chemistry and Biochemistry,University of California, San Diego

Summary

이 원고는 단일 입자 극저온 전자 현미경 검사법을 위해 생물학적 표본을 수동으로 동결하는 블롯 앤 플런지 방법을 설명합니다.

Abstract

단일 입자 극저온 전자 현미경 검사법(cryoEM)에 의한 고해상도 구조 측정을 위해 전자를 사용한 이미징 생물학적 표본은 관심있는 생체 분자를 포함하는 유리체 얼음의 얇은 층을 필요로한다. 구조 생물학의 최전선에 단일 입자 극저온을 추진 한 최근 몇 년 동안 수많은 기술 진보에도 불구하고, 표본이 고해상도 이미징을 위해 유리화되는 방법은 종종 속도 제한 단계로 남아 있습니다. 최근 수많은 노력이 새로운 샘플 지원 및 혁신적인 유리화 계측의 개발을 포함하여 표본 병보 시 자주 발생하는 장애물을 극복하는 수단을 제공했지만, 기존의 수동으로 작동하는 플런서는 구매 비용과 운영 편의성으로 인해 냉동 EM 커뮤니티의 필수품으로 남아 있습니다. 여기서, 우리는 단일 입자 극저온에 의한 고해상도 이미징을 위한 생물학적 표본의 진동을 위해 표준, 기로틴 스타일의 수동으로 작동하는 블롯 및 플런지 장치를 사용하기위한 상세한 방법을 제공합니다. 또한 표준 준비가 적합한 시편을 산출하지 못하는 경우 일반적으로 발생하는 문제와 문제 해결 권장 사항도 설명되어 있습니다.

Introduction

단일 입자 극저온 전자 현미경 검사법(cryoEM)은 동적 생물학적 표본의 구조를 거의 원자 분해능1,2,3,4로 해결하는 데 사용할 수 있는 강력한 구조 기술입니다. 실제로, 최근 직전자 검출기 기술의 발전4,5,6,7,8,9,10, 전자 소스의 개선4,11,12,13,14, 전자기 렌즈 안정성15, 데이터 수집의 지속적인 개발과 함께 16,17 및 분석 소프트웨어 패키지18,19, 연구원은 지금 정기적으로 3 Å 해상도 또는 더 나은 에 잘 행동 표본의 구조를 결정할 수 있습니다4,11,13,14,20,21,22,23 . 이러한 향상된 이미징 및 데이터 처리 기능에도 불구하고 cryoEM 그리드 준비는 성공적인 고해상도 구조 측정을 위한 가장 큰 장애물로 남아 있으며 EM 워크플로224,25,26,27에서 상당한 병목 현상역할을 합니다.

CryoEM은 기본 생화학 상태를 보존하는 “유리와 같은” 얼음의 박막을 형성하기 위해 동결된 수성 용액에서 생물학적 시료의 이미징에 의존합니다. 극저온에 대한 생물학적 시료의 진동은 40년 이상 거슬러 올라가며, 이 공정을 위해 개발된 많은 기술과 장비는 원래 상세한 블롯 및 플런지 방법에 의존하여 31,32,33,34,35에 의존합니다. , 이에 의하면 소량의 샘플(예를 들어, 1-5 μL)이 전문화된 EM 그리드에 적용되어 초과 용액이 블로팅 페이퍼와 그리드의 물리적 상호 작용을 이용하여 제거된다. 이 과정의 타이밍은 일반적으로 각 시편에 대해 실증적으로 결정되며, 동결 시료의 중요한 성분은 유리체 얼음 필름의 두께입니다 – 얼음이 너무 두꺼워지면 너무 얇은 얼음이 너무 얇아단백질 배향을 제한하고/또는 그리드 호일 홀의 중심에서 입자를 배제할 수 있는 동안 이미징 품질이 급격히 저하됩니다36 . 단일 입자 극저온에 대한 완벽한 얼음 두께에 대한 이러한 의존은 로봇 공학 37,38, 미세 유체 42, 초음파 또는 살 포 장치 27,39,40,41,42,43,44 를 포함하여 샘플을 동결 할 수있는 다양한 기술과 장비를 주도하고있다 . 최근 몇 년 동안 가장 인기있는 샘플 준비 장치 중 일부는 블롯 및 플런지 기술을 사용하여 샘플의 자동 동결을 위한 로봇 공학의 사용에 의존합니다45. 이러한 장치는 이미징에 적합한 얼음 두께를 재현적으로 생성하도록 설계되었지만 개별 실험실에서 구매 및 작동하기에는 비용이 너무 많이 들며 일반적으로 사용량을 위해 시간당 가격으로 극저온EM 시설에서 발견됩니다. 최근 몇 년 동안, 원래 수동 블롯 및 플런지 기술은 증가 사용으로 돌아왔다3,47,48,49,50,51,52. 실제로 수동으로 작동하는 블롯 앤 플런지 장치는 로봇 대응 비용의 일부만으로 고품질 극저온엠 그리드를 달성할 수 있습니다. 또한 수동 블로팅은 연구원이 블로팅 유형(즉, 그리드의 백 블로팅, 그리드의 전면 블로팅 등)을 조정할 수 있으며 각 개별 샘플 및 연구 질문에 따라 시간을 낭비할 수 있기 때문에 더 많은 사용자가 블로팅에 대한 제어력을 제공합니다.

이 문서에서는 맞춤형 드워 플랫폼53과 결합된 기존의 수동 블롯 및 플런지 진동 장치를 사용하여 생물학적 샘플을 효과적으로 동결하는 방법에 대한 세부 정보를 제공합니다. 극저온, 그리드 처리, 샘플 응용 프로그램 및 블로팅 을 포함한 모범 사례뿐만 아니라 이러한 장애물을 극복하는 방법에 대한 일반적인 함정 및 권장 사항이 제공됩니다. 그리드 제제 간의 얼음 두께 재현성을 높이는 방법과 생물학적 표본 유형에 따라 샘플 블로팅을 수정하는 방법에 대한 조언이 논의됩니다. 이 원고에 설명된 수동 플런저의 구매 및 작동과 관련된 저렴한 비용을 감안할 때, 전 세계 실험실은 비용 효율적이고 재현 가능한 방식으로 극저온에 대한 생물학적 표본을 준비할 수 있습니다.

Protocol

1. 수동 급락 환경 준비 참고: 예상 작동 시간: 5-30분 가습기가 공동 배치될 수 있는 4°C 콜드룸에서 수동 플런저를 찾아 100% 상대 습도(RH) (도 1A)에 가깝게 방을 유지한다.주의: 수동 플런저 및 권장 작업의 안전한 위치에 대한 기관의 환경 보건 및 안전 지침에 문의하십시오. 그리드 준비 에 앞서, 차가운 방의 RH가 95 %≥ 보장하기 위해 차…

Representative Results

여기에 설명된 블롯 및 플런지 프로토콜의 성공적인 실행은 전자 현미경하에서 관찰될 수 있는 어떤 육각형 얼음, 오염 물질 및 큰 그라데이션이 없는 얇고 균일한 유리체 얼음층을 초래할 것이다(그림 3). 그리드 표면과 블로팅 용지의 일관되지 않은 접촉, 블로팅 용지를 조기에 제거하거나 그리드 접촉 중에 블로팅 용지를 이동하면 유리체 얼음의 품질을 저하시키고 EM 그?…

Discussion

단일 입자 극저온 전자 현미경 검사법(cryoEM)에 의한 이미징을 위한 생물학적 표본의 진동은 성공적인 구조 결정에 매우 중요한 단계로 남아 있습니다. 이 프로토콜에 설명된 수동 블롯 앤 플런지 방법은 극저온 이미징을 위한 유리체 얼음 의 박막에서 생물학적 샘플을 신속하게 동결하는 비용 효율적이고 신뢰할 수 있으며 견고한 방법을 나타냅니다. 원고에 설명된 방법을 사용하여, 연구원은 수?…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Herzik 랩 회원들에게 이 원고와 비디오 콘텐츠에 대해 비판적으로 생각하고 피드백을 제공해 주신 것에 감사드립니다. M.A.H.주니어는 NIH R35 GM138206과 시얼 학자의 지원을 받고 있습니다. H.P.M.N은 분자 생물물리학 훈련 보조금(NIH T32 GM008326)에 의해 지원됩니다. 또한 스크립스 연구소의 빌 앤더슨, 찰스 보우먼, 가브리엘 랜더 박사에게 비디오에 표시된 수동 플런저를 설계, 조립 및 테스트하는 데 도움을 주신 것에 대해 감사드립니다.

Materials

4 slot grid storage box Ted Pella 160-40
14 gauge flat metal dispensing tip Amazon B07M7YWWLT
22×22 mm square glass coverslip Sigma C9802-1PAK
60 mm glass Petri dish to store grids Fisher 08-747A
100 mm glass Petri dish to store Whatman paper Fisher 08-747D
150 mm glass Petri dish to store Whatman paper Fisher 08-747F
250 mL beaker Fisher 02-555-25B
Blue styrofoam dewar Spear Lab FD-500
Brass ethane vessel Lasco 17-4075
Clamping tweezers Ted Pella 38825
Delicate task wipes Fisher 06-666
Dual-stage regulator with control valve Airgas Y12N245D580-AG
Dewer grid base UCSD
Ethane platform UCSD
Ethane propane tank Praxair ET PR50ZU-G ethane (50%) : propane (50%) in a high-pressure tank
Ethane tank Praxair UN1035 ethane (100%)
Flexible arm task light Amscope LED-11CR
Grids (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 mesh) Electron Microscopy Sciences Q325AR1.3
Humidifier Target 719438
Hygrometer ThermoPro B01H1R0K68
Lab coat UCSD
Liquid Nitrogen dewar Worthington LD4
Liquid Nitrogen gloves Fisher 19-059-925
Manual plunger stand (black stand + foot pedal) UCSD
Mark 5 (plunging platform) UCSD
Nitrile gloves VWR 82026-424
P20 pipette Eppendorf 13-690-029
PCR tubes Eppendorf E0030124286
Pipette tips ibis scientific 63300005
Ring lamp Amazon B07HMR4H8G
Safety glasses UCSD
Scissors Amazon Fiskars 01-004761J
Screw driver Ironside 354711
Tape Fisher 15-901-10R
Tweezer to transfer grid box Amazon LTS-3
Tygon tubing Fisher 14-171-130
Whatman blotting paper Fisher 1001-090
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Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, Jr., M. A. Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (180), e62765, doi:10.3791/62765 (2022).
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