JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Traducción Automática
Bioquímica

Congelamento manual de amostras biológicas para microscopia eletrônica criogênica de partículas únicas

Published: February 07, 2022
doi:
10.3791/62765
, , ,
1Department of Chemistry and Biochemistry,University of California, San Diego

Summary

Este manuscrito descreve o método de mancha e mergulho para congelar manualmente espécimes biológicos para microscopia eletrônica criogênica de partículas únicas.

Abstract

Imagens de amostras biológicas com elétrons para determinação de estrutura de alta resolução por microscopia eletrônica criogênica de partículas únicas (crioEM) requer uma fina camada de gelo vítreo contendo as biomoléculas de interesse. Apesar de numerosos avanços tecnológicos nos últimos anos que impulsionaram o crioEM de partículas únicas à vanguarda da biologia estrutural, os métodos pelos quais os espécimes são vitrificados para imagens de alta resolução muitas vezes permanecem o passo limitante da taxa. Embora numerosos esforços recentes tenham proporcionado meios para superar obstáculos frequentemente encontrados durante a vitrificação de espécimes, incluindo o desenvolvimento de novos suportes de amostras e instrumentação inovadora de vitrificação, o tradicional êmbolo operado manualmente continua sendo um grampo na comunidade crioem devido ao baixo custo de compra e facilidade de operação. Aqui, fornecemos métodos detalhados para o uso de um dispositivo padrão, no estilo guilhotina operado manualmente para a vitrificação de amostras biológicas para imagens de alta resolução por crioEM de uma única partícula. Além disso, problemas comumente encontrados e recomendações de solução de problemas para quando uma preparação padrão não produz uma amostra adequada também são descritas.

Introduction

Microscopia criogênica de elétrons de partículas únicas (crioEM) é uma técnica estrutural poderosa que pode ser usada para resolver estruturas de espécimes biológicos dinâmicos para resolução quase atômica1,2,3,4. De fato, os recentes avanços nas tecnologias diretas de detector de elétrons4,5,6,7,8,9,10, melhorias nas fontes de elétrons4,11,12,13,14, e estabilidade de lentes eletromagnéticas15, juntamente com o desenvolvimento contínuo da aquisição de dados 16,17 e pacotes de software de análise18,19, permitiram aos pesquisadores determinar rotineiramente estruturas de espécimes bem comportados para resolução de 3 Å ou melhor 4,11,13,14,20,21,22,23 . Apesar desses recursos aprimorados de imagem e processamento de dados, a preparação da rede crioEM continua sendo o maior impedimento para uma determinação bem-sucedida da estrutura de alta resolução e muitas vezes serve como um gargalo considerável no fluxo de trabalho EM24,25,26,27.

O CrioEM baseia-se na imagem de amostras biológicas em soluções aquosas que são congeladas para formar uma fina película de gelo “semelhante a vidro” – um processo conhecido como vitrificação – que preserva o estado bioquímico nativo. A vitrificação de amostras biológicas para crioEM remonta a mais de 40 anos28,29,30 e muitas técnicas e equipamentos que foram desenvolvidos para este processo dependem do método originalmente detalhado de blot-and-plunge31,32,33,34,35 , pelo qual um pequeno volume de amostra (por exemplo, 1-5 μL) é aplicado a uma grade EM especializada antes que a solução em excesso seja removida usando interação física da grade com papel de mancha. O tempo deste processo é geralmente empiricamente determinado para cada espécime como um componente crítico das amostras de congelamento é a espessura do filme de gelo vítreo – se o gelo é muito grosso, então a qualidade da imagem se deteriora dramaticamente devido ao aumento da dispersão do feixe de elétrons, enquanto o gelo que é muito fino pode restringir orientações proteicas e/ou excluir partículas do centro dos buracos de papel alumínio da grade36 . Essa dependência da espessura perfeita do gelo para crioEM de partículas únicas levou a uma ampla gama de técnicas e equipamentos que podem congelar amostras, incluindo robótica37,38, microfluidos42 e dispositivos ultrassônicos ou pulverizadores27,39,40,41,42,43,44 . Nos últimos anos, alguns dos dispositivos de preparação de amostras mais populares dependem do uso de robótica para congelamento automatizado de amostras usando a técnica de blot-and-plunge45. Embora esses dispositivos sejam projetados para criar de forma reprodutivelmente a espessura adequada do gelo para imagens, eles muitas vezes permanecem muito caros para laboratórios individuais comprarem e operarem e são geralmente encontrados dentro de instalações crioEM a taxas horárias para uso. Nos últimos anos, a técnica original de blot-and-plunge manual voltou a ser usada em aumento3,47,48,49,50,51,52. De fato, um dispositivo de blot-and-plunge operado manualmente pode alcançar grades crioEM de alta qualidade a uma fração do custo das contrapartes robóticas. Além disso, a mancha manual também oferece mais controle dos usuários sobre a mancha, pois os pesquisadores podem ajustar o tipo de mancha (ou seja, mancha traseira da grade, mancha frontal da grade, etc.), e tempo de mancha com base em cada amostra individual e questões de pesquisa.

Neste artigo, fornecemos detalhes sobre como congelar efetivamente amostras biológicas usando um dispositivo de vitrificação manual tradicional, juntamente com uma plataforma de guerra personalizada53. As melhores práticas, incluindo preparação do criogen, manuseio da grade, aplicação da amostra e manchas, bem como armadilhas e recomendações comuns sobre como superar esses obstáculos são fornecidas. São discutidos conselhos sobre como aumentar a reprodutibilidade da espessura do gelo entre as preparações da rede e como modificar a mancha de amostra com base no tipo de espécime biológico. Dado o baixo custo associado à compra e operação do êmbolo manual descrito neste manuscrito, laboratórios em todo o mundo podem preparar espécimes biológicos para crioEM de forma econômica e reprodutível.

Protocol

1. Prepare o ambiente manual de mergulho NOTA: Tempo estimado de funcionamento: 5-30 minutos Localize o êmbolo manual em uma sala fria de 4 °C onde um umidificador possa ser co-localizado para manter a sala perto de 100% de umidade relativa (RH) (Figura 1A).ATENÇÃO: Consulte as diretrizes de Saúde e Segurança Ambiental da instituição para a localização segura do êmbolo manual e as operações recomendadas. Antes da preparação d…

Representative Results

A execução bem sucedida do protocolo de manchas e mergulho descrito aqui resultará em uma fina camada uniforme de gelo vítreo que está livre de qualquer gelo hexagonal, contaminantes e grandes gradientes de gelo inutilizável que podem ser observados sob o microscópio eletrônico (Figura 3). O contato inconsistente do papel de mancha com a superfície da grade, removendo prematuramente o papel de mancha, ou movendo o papel de mancha durante o contato com a rede pode diminuir a qualidad…

Discussion

A vitrificação de espécimes biológicos para imagem por microscopia eletrônica criogênica de partículas únicas (crioEM) continua sendo um passo criticamente importante para a determinação bem sucedida da estrutura. O método manual de blot-and-plunge descrito neste protocolo representa um método econômico, confiável e robusto para congelar rapidamente amostras biológicas em filmes finos de gelo vítreo para imagens crioEM. Usando os métodos descritos no manuscrito, os pesquisadores poderão montar e operar …

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos aos membros do laboratório Herzik por pensarem criticamente e fornecerem feedback sobre este manuscrito e o conteúdo do vídeo. M.A.H.Jr. é apoiado pelo NIH R35 GM138206 e como um Estudioso searle. H.P.M.N é apoiado pelo Molecular Biophysics Training Grant (NIH T32 GM008326). Também gostaríamos de agradecer a Bill Anderson, Charles Bowman e Dr. Gabriel Lander no Scripps Research Institute por ajudar a projetar, montar e testar o êmbolo manual mostrado no vídeo.

Materials

4 slot grid storage box Ted Pella 160-40
14 gauge flat metal dispensing tip Amazon B07M7YWWLT
22×22 mm square glass coverslip Sigma C9802-1PAK
60 mm glass Petri dish to store grids Fisher 08-747A
100 mm glass Petri dish to store Whatman paper Fisher 08-747D
150 mm glass Petri dish to store Whatman paper Fisher 08-747F
250 mL beaker Fisher 02-555-25B
Blue styrofoam dewar Spear Lab FD-500
Brass ethane vessel Lasco 17-4075
Clamping tweezers Ted Pella 38825
Delicate task wipes Fisher 06-666
Dual-stage regulator with control valve Airgas Y12N245D580-AG
Dewer grid base UCSD
Ethane platform UCSD
Ethane propane tank Praxair ET PR50ZU-G ethane (50%) : propane (50%) in a high-pressure tank
Ethane tank Praxair UN1035 ethane (100%)
Flexible arm task light Amscope LED-11CR
Grids (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 mesh) Electron Microscopy Sciences Q325AR1.3
Humidifier Target 719438
Hygrometer ThermoPro B01H1R0K68
Lab coat UCSD
Liquid Nitrogen dewar Worthington LD4
Liquid Nitrogen gloves Fisher 19-059-925
Manual plunger stand (black stand + foot pedal) UCSD
Mark 5 (plunging platform) UCSD
Nitrile gloves VWR 82026-424
P20 pipette Eppendorf 13-690-029
PCR tubes Eppendorf E0030124286
Pipette tips ibis scientific 63300005
Ring lamp Amazon B07HMR4H8G
Safety glasses UCSD
Scissors Amazon Fiskars 01-004761J
Screw driver Ironside 354711
Tape Fisher 15-901-10R
Tweezer to transfer grid box Amazon LTS-3
Tygon tubing Fisher 14-171-130
Whatman blotting paper Fisher 1001-090
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Hofmann, S., et al. Conformation Space of a Heterodimeric ABC Exporter under Turnover Conditions. Nature. 571 (7766), 580-583 (2019).
  2. Fica, S. M., Nagai, K. Cryo-Electron Microscopy Snapshots of the Spliceosome: Structural Insights into a Dynamic Ribonucleoprotein Machine. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (10), 791-799 (2017).
  3. Hirschi, M., et al. Cryo-Electron Microscopy Structure of the Lysosomal Calcium-Permeable Channel TRPML3. Nature. 550 (7676), 411-414 (2017).
  4. Nakane, T., et al. Single-Particle Cryo-EM at Atomic Resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
  5. Li, X., Zheng, S. Q., Egami, K., Agard, D. A., Cheng, Y. Influence of Electron Dose Rate on Electron Counting Images Recorded with the K2 Camera. Journal of Structural Biology. 184 (2), 251-260 (2013).
  6. Campbell, M. G., et al. Movies of Ice-Embedded Particles Enhance Resolution in Electron Cryo-Microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
  7. Brilot, A. F., et al. Beam-Induced Motion of Vitrified Specimen on Holey Carbon Film. Journal of Structural Biology. 177 (3), 630-637 (2012).
  8. McMullan, G., et al. Experimental Observation of the Improvement in MTF from Backthinning a CMOS Direct Electron Detector. Ultramicroscopy. 109 (9), 1144-1147 (2009).
  9. Feathers, J. R., Spoth, K. A., Fromme, J. C. Experimental evaluation of super-resolution imaging and magnification choice in single-particle cryo-EM. Journal of Structural Biology: X. 5, 100047 (2021).
  10. Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: Anisotropic Correction of Beam-Induced Motion for Improved Cryo-Electron Microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  11. Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-Resolution Protein Structure Determination by Cryo-EM. Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).
  12. Fislage, M., Shkumatov, A. V., Stroobants, A., Efremov, R. G. Assessing the JEOL CRYO ARM 300 for High-Throughput Automated Single-Particle Cryo-EM in a Multiuser Environment. IUCrJ. 7 (4), 707-718 (2020).
  13. Zhang, K., Pintilie, G. D., Li, S., Schmid, M. F., Chiu, W. Resolving Individual Atoms of Protein Complex by Cryo-Electron Microscopy. Cell Research. 30 (12), 1136-1139 (2020).
  14. Danev, R., Yanagisawa, H., Kikkawa, M. Cryo-Electron Microscopy Methodology: Current Aspects and Future Directions. Trends in Biochemical Sciences. 44 (10), 837-848 (2019).
  15. Herzik, M. A. Cryo-Electron Microscopy Reaches Atomic Resolution. Nature. 587 (7832), 39-40 (2020).
  16. Cheng, A., et al. Leginon: New Features and Applications. Protein Science. 30 (1), 136-150 (2021).
  17. Suloway, C., et al. Automated Molecular Microscopy: The New Leginon System. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
  18. de la Rosa-Trevín, J. M., et al. Scipion: A Software Framework toward Integration, Reproducibility and Validation in 3D Electron Microscopy. Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).
  19. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for Rapid Unsupervised Cryo-EM Structure Determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  20. Danev, R., Tegunov, D., Baumeister, W. Using the Volta Phase Plate with Defocus for Cryo-EM Single Particle Analysis. eLife. 6, 23006 (2017).
  21. Naydenova, K., Jia, P., Russo, C. J. Cryo-EM with Sub-1 Å Specimen Movement. Science. 370 (6513), 223-226 (2020).
  22. Watson, Z. L., et al. Structure of the Bacterial Ribosome at 2 Å Resolution. eLife. 9, 60482 (2020).
  23. Josephs, T. M., et al. Structure and Dynamics of the CGRP Receptor in Apo and Peptide-Bound Forms. Science. 372 (6538), (2021).
  24. Tan, Y. Z., et al. Addressing Preferred Specimen Orientation in Single-Particle Cryo-EM through Tilting. Nature Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
  25. D’Imprima, E., Floris, D., Joppe, M., Sánchez, R., Grininger, M., Kühlbrandt, W. Protein Denaturation at the Air-Water Interface and How to Prevent It. eLife. 8, 42747 (2019).
  26. Han, Y., et al. High-Yield Monolayer Graphene Grids for near-Atomic Resolution Cryoelectron Microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (2), 1009-1014 (2020).
  27. Dandey, V. P., et al. Time-Resolved Cryo-EM Using Spotiton. Nature Methods. 17 (9), 897-900 (2020).
  28. McDowall, A. W., et al. Electron Microscopy of Frozen Hydrated Sections of Vitreous Ice and Vitrified Biological Samples. Journal of Microscopy. 131 (1), 1-9 (1983).
  29. Dubochet, J., McDowall, A. W. Vitrification of pure water for electron microscopy. Journal of Microscopy. 124 (3), 3-4 (1981).
  30. Dubochet, J., McDowall, A. W., Menge, B., Schmid, E. N., Lickfeld, K. G. Electron Microscopy of Frozen-Hydrated Bacteria. Journal of Bacteriology. 155 (1), 381-390 (1983).
  31. Depelteau, J. S., Koning, G., Yang, W., Briegel, A. An Economical, Portable Manual Cryogenic Plunge Freezer for the Preparation of Vitrified Biological Samples for Cryogenic Electron Microscopy. Microscopy and Microanalysis. 26 (3), 413-418 (2020).
  32. Dobro, M. J., Melanson, L. A., Jensen, G. J., McDowall, A. W. Plunge Freezing for Electron Cryomicroscopy. Methods in Enzymology. 481, 63-82 (2010).
  33. Cavalier, A., Spehner, D., Humbel, B. M. Handbook of Cryo-Preparation Methods for Electron Microscopy. Microscopy and Microanalysis. 15 (5), 469-470 (2009).
  34. Grassucci, R. A., Taylor, D. J., Frank, J. Preparation of Macromolecular Complexes for Cryo-Electron Microscopy. Nat. Protoc. 2 (12), 3239-3246 (2007).
  35. Carragher, B., et al. Current Outcomes When Optimizing ‘Standard’ Sample Preparation for Single-particle Cryo-EM. Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).
  36. Noble, A. J., et al. Routine Single Particle CryoEM Sample and Grid Characterization by Tomography. eLife. 7, 34257 (2018).
  37. Resch, G. P., Brandstetter, M., Konigsmaier, L., Urban, E., Pickl-Herk, A. M. Immersion Freezing of Suspended Particles and Cells for Cryo-Electron Microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 803-814 (2011).
  38. Resch, G. P., et al. Immersion Freezing of Biological Specimens: Rationale, Principles, and Instrumentation. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 778-782 (2011).
  39. Jain, T., Sheehan, P., Crum, J., Carragher, B., Potter, C. S. Spotiton: A Prototype for an Integrated Inkjet Dispense and Vitrification System for Cryo-TEM. Journal of Structural Biology. 179 (1), 68-75 (2012).
  40. Razinkov, I., et al. A New Method for Vitrifying Samples for CryoEM. Journal of Structural Biology. 195 (2), 190-198 (2016).
  41. Dandey, V. P., et al. Spotiton: New Features and Applications. Journal of Structural Biology. 202 (2), 161-169 (2018).
  42. Lu, Z., et al. Monolithic Microfluidic Mixing-Spraying Devices for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy. Journal of Structural Biology. 168 (3), 388-395 (2009).
  43. Feng, X., et al. A Fast and Effective Microfluidic Spraying-Plunging Method for High-Resolution Single-Particle Cryo-EM. Structure. 25 (4), 663-670 (2017).
  44. Rubinstein, J. L., et al. Shake-It-off: A Simple Ultrasonic Cryo-EM Specimen-Preparation Device. Acta Crystallographica Section D. 75 (12), 1063-1070 (2019).
  45. Lawson, C. L., et al. EMDataBank.Org: Unified Data Resource for CryoEM. Nucleic Acids Res. 39, 456-464 (2011).
  46. Frederik, P. M., Hubert, D. H. Cryoelectron Microscopy of Liposomes. Methods in Enzymology. 391, 431-448 (2005).
  47. Dambacher, C. M., Worden, E. J., Herzik, M. A., Martin, A., Lander, G. C. Atomic Structure of the 26S Proteasome Lid Reveals the Mechanism of Deubiquitinase Inhibition. eLife. 5, 13027 (2016).
  48. Zubcevic, L., et al. Conformational Ensemble of the Human TRPV3 Ion Channel. Nature Communications. 9 (1), 4773 (2018).
  49. Zubcevic, L., et al. Cryo-Electron Microscopy Structure of the TRPV2 Ion Channel. Nature Structural & Molecular Biology. 23 (2), 180-186 (2016).
  50. Yoo, J., Wu, M., Yin, Y., Herzik, M. A., Lander, G. C., Lee, S. -. Y. Cryo-EM Structure of a Mitochondrial Calcium Uniporter. Science. 361 (6401), 506-511 (2018).
  51. Fribourgh, J. L., et al. Dynamics at the Serine Loop Underlie Differential Affinity of Cryptochromes for CLOCK:BMAL1 to Control Circadian Timing. eLife. 9, 55275 (2020).
  52. Hirschi, M., et al. AcrIF9 Tethers Non-Sequence Specific DsDNA to the CRISPR RNA-Guided Surveillance Complex. Nature Communications. 11 (1), 2730 (2020).
  53. Herzik, M. A. Manual-Plunging CryoEM Grids | Herzik Lab. Herzik Lab UCSD. , (2021).

Tags

Keywords: Manual Blot-and-plunge FreezingBiological SpecimensSingle-particle Cryogenic Electron MicroscopyTransmission Electron MicroscopyCryogen DewarManual PlungerEthane VesselPlunging ArmCryogen PreparationLiquid NitrogenEthane Gas
check_url/es/62765?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, Jr., M. A. Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (180), e62765, doi:10.3791/62765 (2022).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image