Ручное замораживание биологических образцов для одночастичной криогенной электронной микроскопии
Summary
В этой рукописи описывается метод блоттинга и погружения для ручной заморозки биологических образцов для криогенной электронной микроскопии с одной частицей.
Abstract
Визуализация биологических образцов с электронами для определения структуры высокого разрешения с помощью криогенной электронной микроскопии с одной частицей (криоЭМ) требует тонкого слоя стекловидного льда, содержащего биомолекулы, представляющие интерес. Несмотря на многочисленные технологические достижения в последние годы, которые вывели криоЭМ на передний план структурной биологии, методы, с помощью которых образцы остекливаются для визуализации с высоким разрешением, часто остаются этапом ограничения скорости. Хотя многочисленные недавние усилия обеспечили средства для преодоления препятствий, часто встречающихся во время витрификации образцов, включая разработку новых опор для образцов и инновационных приборов для витрификации, традиционный плунжер с ручным управлением остается основным продуктом в сообществе криоЭМ из-за низкой стоимости покупки и простоты эксплуатации. Здесь мы приводим подробные методы использования стандартного гильотинного устройства с ручным управлением для витрификации биологических образцов для визуализации с высоким разрешением с помощью криоЭМ. Кроме того, также описываются часто встречающиеся проблемы и рекомендации по устранению неполадок, когда стандартная подготовка не дает подходящего образца.
Introduction
Одночастичная криогенная электронная микроскопия (криоЭМ) является мощным структурным методом, который может быть использован для решения структур динамических биологических образцов с околоатомным разрешением1,2,3,4. Действительно, последние достижения в технологиях прямых детекторов электронов4,5,6,7,8,9,10, улучшения в электронных источниках4,11,12,13,14 и стабильности электромагнитных линз15 в сочетании с продолжающимся развитием сбора данных 16,17 и пакеты программного обеспечения для анализа18,19 позволили исследователям в настоящее время регулярно определять структуры хорошо ведущих себя образцов с разрешением 3 Å или лучше4,11,13,14,20,21,22,23 . Несмотря на эти улучшенные возможности визуализации и обработки данных, подготовка сетки криоЭМ остается самым большим препятствием для успешного определения структуры с высоким разрешением и часто служит значительным узким местом в рабочем процессе EM24,25,26,27.
CryoEM полагается на визуализацию биологических образцов в водных растворах, которые замораживаются с образованием тонкой пленки «стеклоподобного» льда – процесс, известный как витрификация – который сохраняет исходное биохимическое состояние. Витрификация биологических образцов для криоЭМ насчитывает более 40 лет28,29,30, и многие методы и оборудование, которые были разработаны для этого процесса, основаны на первоначально детальном методе пятнистости и погружения31,32,33,34,35 , при этом небольшой объем образца (например, 1-5 мкл) наносится на специализированную ЭМ-сетку перед удалением избыточного раствора с помощью физического взаимодействия сетки с промокательной бумагой. Сроки этого процесса обычно эмпирически определяются для каждого образца, поскольку критическим компонентом замораживания образцов является толщина стекловидной ледяной пленки – если лед слишком толстый, то качество изображения резко ухудшается из-за увеличения рассеяния электронного пучка, в то время как слишком тонкий лед может ограничивать ориентацию белка и / или исключать частицы из центра отверстий фольги сетки36 . Эта зависимость от идеальной толщины льда для криоЭМ с одной частицей привела к широкому спектру методов и оборудования, которые могут замораживать образцы, включая робототехнику37,38, микрофлюидику42 и ультразвуковые или распылительные устройства27,39,40,41,42,43,44 . В последние годы некоторые из самых популярных устройств для подготовки образцов полагаются на использование робототехники для автоматизированной заморозки образцов с использованием метода пятнистости и погружения45. Хотя эти устройства предназначены для воспроизводимого создания надлежащей толщины льда для визуализации, они часто остаются слишком дорогими для отдельных лабораторий для покупки и эксплуатации и, как правило, находятся в криоЭМ-объектах по почасовым ставкам для использования. В последние годы оригинальная ручная техника промокания и погружения вернулась в более широкое использование3,47,48,49,50,51,52. Действительно, устройство с ручным управлением может достигать высококачественных криоЭМ-сетей за небольшую часть стоимости роботизированных аналогов. Кроме того, ручное блоттинг также предлагает пользователям больше контроля над блоттингом, поскольку исследователи могут корректировать тип блоттинга (т. Е. Обратное блоттирование сетки, переднее блоттирование сетки и т. Д.), И время блоттинга на основе каждого отдельного образца и исследовательских вопросов.
В этой статье мы подробно расскажем о том, как эффективно замораживать биологические образцы с помощью традиционного ручного устройства витрификации в сочетании с специально разработанной платформой dewar53. Приведены лучшие практики, включая подготовку криогена, обработку сетки, применение образцов и блоттинг, а также распространенные подводные камни и рекомендации о том, как преодолеть эти препятствия. Обсуждаются рекомендации о том, как увеличить воспроизводимость толщины льда между препаратами сетки и как модифицировать блоттинг образцов на основе типа биологического образца. Учитывая низкую стоимость, связанную с покупкой и эксплуатацией ручного плунжера, описанного в этой рукописи, лаборатории по всему миру могут подготовить биологические образцы для криоЭМ экономически эффективным и воспроизводимым способом.
Protocol
Representative Results
Discussion
Витрификация биологических образцов для визуализации с помощью криогенной электронной микроскопии с одной частицей (криоЭМ) остается критически важным шагом для успешного определения структуры. Ручной метод пятнистости и погружения, описанный в этом протоколе, представляет собой эк…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим членов лаборатории Herzik за критическое мышление и предоставление отзывов об этой рукописи и видеоконтенте. M.A.H.Jr. поддерживается NIH R35 GM138206 и как стипендиат Searle. H.P.M.N поддерживается грантом на обучение молекулярной биофизике (NIH T32 GM008326). Мы также хотели бы поблагодарить Билла Андерсона, Чарльза Боумана и доктора Габриэля Ландера из Научно-исследовательского института Скриппса за помощь в проектировании, сборке и тестировании ручного плунжера, показанного в видео.
Materials
| 4 slot grid storage box | Ted Pella | 160-40 | |
| 14 gauge flat metal dispensing tip | Amazon | B07M7YWWLT | |
| 22×22 mm square glass coverslip | Sigma | C9802-1PAK | |
| 60 mm glass Petri dish to store grids | Fisher | 08-747A | |
| 100 mm glass Petri dish to store Whatman paper | Fisher | 08-747D | |
| 150 mm glass Petri dish to store Whatman paper | Fisher | 08-747F | |
| 250 mL beaker | Fisher | 02-555-25B | |
| Blue styrofoam dewar | Spear Lab | FD-500 | |
| Brass ethane vessel | Lasco | 17-4075 | |
| Clamping tweezers | Ted Pella | 38825 | |
| Delicate task wipes | Fisher | 06-666 | |
| Dual-stage regulator with control valve | Airgas | Y12N245D580-AG | |
| Dewer grid base | UCSD | ||
| Ethane platform | UCSD | ||
| Ethane propane tank | Praxair | ET PR50ZU-G | ethane (50%) : propane (50%) in a high-pressure tank |
| Ethane tank | Praxair | UN1035 | ethane (100%) |
| Flexible arm task light | Amscope | LED-11CR | |
| Grids (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 mesh) | Electron Microscopy Sciences | Q325AR1.3 | |
| Humidifier | Target | 719438 | |
| Hygrometer | ThermoPro | B01H1R0K68 | |
| Lab coat | UCSD | ||
| Liquid Nitrogen dewar | Worthington | LD4 | |
| Liquid Nitrogen gloves | Fisher | 19-059-925 | |
| Manual plunger stand (black stand + foot pedal) | UCSD | ||
| Mark 5 (plunging platform) | UCSD | ||
| Nitrile gloves | VWR | 82026-424 | |
| P20 pipette | Eppendorf | 13-690-029 | |
| PCR tubes | Eppendorf | E0030124286 | |
| Pipette tips | ibis scientific | 63300005 | |
| Ring lamp | Amazon | B07HMR4H8G | |
| Safety glasses | UCSD | ||
| Scissors | Amazon | Fiskars 01-004761J | |
| Screw driver | Ironside | 354711 | |
| Tape | Fisher | 15-901-10R | |
| Tweezer to transfer grid box | Amazon | LTS-3 | |
| Tygon tubing | Fisher | 14-171-130 | |
| Whatman blotting paper | Fisher | 1001-090 |
Referencias
- Hofmann, S., et al. Conformation Space of a Heterodimeric ABC Exporter under Turnover Conditions. Nature. 571 (7766), 580-583 (2019).
- Fica, S. M., Nagai, K. Cryo-Electron Microscopy Snapshots of the Spliceosome: Structural Insights into a Dynamic Ribonucleoprotein Machine. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (10), 791-799 (2017).
- Hirschi, M., et al. Cryo-Electron Microscopy Structure of the Lysosomal Calcium-Permeable Channel TRPML3. Nature. 550 (7676), 411-414 (2017).
- Nakane, T., et al. Single-Particle Cryo-EM at Atomic Resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
- Li, X., Zheng, S. Q., Egami, K., Agard, D. A., Cheng, Y. Influence of Electron Dose Rate on Electron Counting Images Recorded with the K2 Camera. Journal of Structural Biology. 184 (2), 251-260 (2013).
- Campbell, M. G., et al. Movies of Ice-Embedded Particles Enhance Resolution in Electron Cryo-Microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
- Brilot, A. F., et al. Beam-Induced Motion of Vitrified Specimen on Holey Carbon Film. Journal of Structural Biology. 177 (3), 630-637 (2012).
- McMullan, G., et al. Experimental Observation of the Improvement in MTF from Backthinning a CMOS Direct Electron Detector. Ultramicroscopy. 109 (9), 1144-1147 (2009).
- Feathers, J. R., Spoth, K. A., Fromme, J. C. Experimental evaluation of super-resolution imaging and magnification choice in single-particle cryo-EM. Journal of Structural Biology: X. 5, 100047 (2021).
- Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: Anisotropic Correction of Beam-Induced Motion for Improved Cryo-Electron Microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
- Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-Resolution Protein Structure Determination by Cryo-EM. Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).
- Fislage, M., Shkumatov, A. V., Stroobants, A., Efremov, R. G. Assessing the JEOL CRYO ARM 300 for High-Throughput Automated Single-Particle Cryo-EM in a Multiuser Environment. IUCrJ. 7 (4), 707-718 (2020).
- Zhang, K., Pintilie, G. D., Li, S., Schmid, M. F., Chiu, W. Resolving Individual Atoms of Protein Complex by Cryo-Electron Microscopy. Cell Research. 30 (12), 1136-1139 (2020).
- Danev, R., Yanagisawa, H., Kikkawa, M. Cryo-Electron Microscopy Methodology: Current Aspects and Future Directions. Trends in Biochemical Sciences. 44 (10), 837-848 (2019).
- Herzik, M. A. Cryo-Electron Microscopy Reaches Atomic Resolution. Nature. 587 (7832), 39-40 (2020).
- Cheng, A., et al. Leginon: New Features and Applications. Protein Science. 30 (1), 136-150 (2021).
- Suloway, C., et al. Automated Molecular Microscopy: The New Leginon System. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
- de la Rosa-Trevín, J. M., et al. Scipion: A Software Framework toward Integration, Reproducibility and Validation in 3D Electron Microscopy. Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for Rapid Unsupervised Cryo-EM Structure Determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Danev, R., Tegunov, D., Baumeister, W. Using the Volta Phase Plate with Defocus for Cryo-EM Single Particle Analysis. eLife. 6, 23006 (2017).
- Naydenova, K., Jia, P., Russo, C. J. Cryo-EM with Sub-1 Å Specimen Movement. Science. 370 (6513), 223-226 (2020).
- Watson, Z. L., et al. Structure of the Bacterial Ribosome at 2 Å Resolution. eLife. 9, 60482 (2020).
- Josephs, T. M., et al. Structure and Dynamics of the CGRP Receptor in Apo and Peptide-Bound Forms. Science. 372 (6538), (2021).
- Tan, Y. Z., et al. Addressing Preferred Specimen Orientation in Single-Particle Cryo-EM through Tilting. Nature Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
- D’Imprima, E., Floris, D., Joppe, M., Sánchez, R., Grininger, M., Kühlbrandt, W. Protein Denaturation at the Air-Water Interface and How to Prevent It. eLife. 8, 42747 (2019).
- Han, Y., et al. High-Yield Monolayer Graphene Grids for near-Atomic Resolution Cryoelectron Microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (2), 1009-1014 (2020).
- Dandey, V. P., et al. Time-Resolved Cryo-EM Using Spotiton. Nature Methods. 17 (9), 897-900 (2020).
- McDowall, A. W., et al. Electron Microscopy of Frozen Hydrated Sections of Vitreous Ice and Vitrified Biological Samples. Journal of Microscopy. 131 (1), 1-9 (1983).
- Dubochet, J., McDowall, A. W. Vitrification of pure water for electron microscopy. Journal of Microscopy. 124 (3), 3-4 (1981).
- Dubochet, J., McDowall, A. W., Menge, B., Schmid, E. N., Lickfeld, K. G. Electron Microscopy of Frozen-Hydrated Bacteria. Journal of Bacteriology. 155 (1), 381-390 (1983).
- Depelteau, J. S., Koning, G., Yang, W., Briegel, A. An Economical, Portable Manual Cryogenic Plunge Freezer for the Preparation of Vitrified Biological Samples for Cryogenic Electron Microscopy. Microscopy and Microanalysis. 26 (3), 413-418 (2020).
- Dobro, M. J., Melanson, L. A., Jensen, G. J., McDowall, A. W. Plunge Freezing for Electron Cryomicroscopy. Methods in Enzymology. 481, 63-82 (2010).
- Cavalier, A., Spehner, D., Humbel, B. M. Handbook of Cryo-Preparation Methods for Electron Microscopy. Microscopy and Microanalysis. 15 (5), 469-470 (2009).
- Grassucci, R. A., Taylor, D. J., Frank, J. Preparation of Macromolecular Complexes for Cryo-Electron Microscopy. Nat. Protoc. 2 (12), 3239-3246 (2007).
- Carragher, B., et al. Current Outcomes When Optimizing ‘Standard’ Sample Preparation for Single-particle Cryo-EM. Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).
- Noble, A. J., et al. Routine Single Particle CryoEM Sample and Grid Characterization by Tomography. eLife. 7, 34257 (2018).
- Resch, G. P., Brandstetter, M., Konigsmaier, L., Urban, E., Pickl-Herk, A. M. Immersion Freezing of Suspended Particles and Cells for Cryo-Electron Microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 803-814 (2011).
- Resch, G. P., et al. Immersion Freezing of Biological Specimens: Rationale, Principles, and Instrumentation. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 778-782 (2011).
- Jain, T., Sheehan, P., Crum, J., Carragher, B., Potter, C. S. Spotiton: A Prototype for an Integrated Inkjet Dispense and Vitrification System for Cryo-TEM. Journal of Structural Biology. 179 (1), 68-75 (2012).
- Razinkov, I., et al. A New Method for Vitrifying Samples for CryoEM. Journal of Structural Biology. 195 (2), 190-198 (2016).
- Dandey, V. P., et al. Spotiton: New Features and Applications. Journal of Structural Biology. 202 (2), 161-169 (2018).
- Lu, Z., et al. Monolithic Microfluidic Mixing-Spraying Devices for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy. Journal of Structural Biology. 168 (3), 388-395 (2009).
- Feng, X., et al. A Fast and Effective Microfluidic Spraying-Plunging Method for High-Resolution Single-Particle Cryo-EM. Structure. 25 (4), 663-670 (2017).
- Rubinstein, J. L., et al. Shake-It-off: A Simple Ultrasonic Cryo-EM Specimen-Preparation Device. Acta Crystallographica Section D. 75 (12), 1063-1070 (2019).
- Lawson, C. L., et al. EMDataBank.Org: Unified Data Resource for CryoEM. Nucleic Acids Res. 39, 456-464 (2011).
- Frederik, P. M., Hubert, D. H. Cryoelectron Microscopy of Liposomes. Methods in Enzymology. 391, 431-448 (2005).
- Dambacher, C. M., Worden, E. J., Herzik, M. A., Martin, A., Lander, G. C. Atomic Structure of the 26S Proteasome Lid Reveals the Mechanism of Deubiquitinase Inhibition. eLife. 5, 13027 (2016).
- Zubcevic, L., et al. Conformational Ensemble of the Human TRPV3 Ion Channel. Nature Communications. 9 (1), 4773 (2018).
- Zubcevic, L., et al. Cryo-Electron Microscopy Structure of the TRPV2 Ion Channel. Nature Structural & Molecular Biology. 23 (2), 180-186 (2016).
- Yoo, J., Wu, M., Yin, Y., Herzik, M. A., Lander, G. C., Lee, S. -. Y. Cryo-EM Structure of a Mitochondrial Calcium Uniporter. Science. 361 (6401), 506-511 (2018).
- Fribourgh, J. L., et al. Dynamics at the Serine Loop Underlie Differential Affinity of Cryptochromes for CLOCK:BMAL1 to Control Circadian Timing. eLife. 9, 55275 (2020).
- Hirschi, M., et al. AcrIF9 Tethers Non-Sequence Specific DsDNA to the CRISPR RNA-Guided Surveillance Complex. Nature Communications. 11 (1), 2730 (2020).
- Herzik, M. A. Manual-Plunging CryoEM Grids | Herzik Lab. Herzik Lab UCSD. , (2021).
