Congelamento manuale blot-and-plunge di campioni biologici per microscopia elettronica criogenica a particella singola
Summary
Questo manoscritto delinea il metodo blot-and-plunge per congelare manualmente i campioni biologici per la microscopia elettronica criogenica a singola particella.
Abstract
L’imaging di campioni biologici con elettroni per la determinazione della struttura ad alta risoluzione mediante microscopia elettronica criogenica a singola particella (cryoEM) richiede un sottile strato di ghiaccio vitreo contenente le biomolecole di interesse. Nonostante i numerosi progressi tecnologici degli ultimi anni che hanno spinto il crioEM a singola particella in prima linea nella biologia strutturale, i metodi con cui i campioni vengono vetrificati per l’imaging ad alta risoluzione spesso rimangono il passo limitante della velocità. Sebbene numerosi sforzi recenti abbiano fornito i mezzi per superare gli ostacoli frequentemente incontrati durante la vetrificazione dei campioni, tra cui lo sviluppo di nuovi supporti per campioni e un’innovativa strumentazione di vitrificazione, il tradizionale stantuffo ad azionamento manuale rimane un punto fermo nella comunità crioEM a causa del basso costo di acquisto e della facilità d’uso. Qui, forniamo metodi dettagliati per l’utilizzo di un dispositivo blot-and-plunge standard a ghigliottina azionato manualmente per la vitrificazione di campioni biologici per l’imaging ad alta risoluzione mediante crioEM a singola particella. Inoltre, vengono descritti anche i problemi comunemente riscontrati e le raccomandazioni per la risoluzione dei problemi per quando una preparazione standard non riesce a produrre un campione adatto.
Introduction
La microscopia elettronica criogenica a singola particella (cryoEM) è una potente tecnica strutturale che può essere utilizzata per risolvere strutture di campioni biologici dinamici a risoluzione quasi atomica1,2,3,4. In effetti, i recenti progressi nelle tecnologie dei rivelatori di elettroni diretti4,5,6,7,8,9,10, i miglioramenti nelle sorgenti di elettroni4,11,12,13,14 e la stabilità delle lenti elettromagnetiche15, insieme al continuo sviluppo dell’acquisizione dei dati 16,17 e pacchetti software di analisi18,19, hanno permesso ai ricercatori di determinare ora di routine strutture di campioni ben educati con risoluzione 3 Å o superiore4,11,13,14,20,21,22,23 . Nonostante queste migliorate capacità di imaging ed elaborazione dei dati, la preparazione della griglia crioEM rimane il principale ostacolo per una determinazione efficace della struttura ad alta risoluzione e spesso funge da collo di bottiglia considerevole nel flusso di lavoro EM24,25,26,27.
CryoEM si basa sull’imaging di campioni biologici in soluzioni acquose che vengono congelate per formare un sottile film di ghiaccio “simile al vetro” – un processo noto come vetrificazione – che preserva lo stato biochimico nativo. La vitrificazione di campioni biologici per crioEM risale a oltre 40 anni28,29,30 e molte tecniche e attrezzature che sono state sviluppate per questo processo si basano sul metodo blot-and-plunge originariamente dettagliato31,32,33,34,35 , per cui un piccolo volume di campione (ad esempio, 1-5 μL) viene applicato a una griglia EM specializzata prima che la soluzione in eccesso venga rimossa utilizzando l’interazione fisica della griglia con la carta assorbente. La tempistica di questo processo è solitamente determinata empiricamente per ciascun campione poiché un componente critico dei campioni di congelamento è lo spessore del film di ghiaccio vitreo – se il ghiaccio è troppo spesso, la qualità dell’immagine si deteriora drammaticamente a causa dell’aumento della dispersione del fascio di elettroni mentre il ghiaccio troppo sottile può limitare gli orientamenti proteici e / o escludere particelle dal centro dei fori della lamina della griglia36 . Questa dipendenza dallo spessore di ghiaccio perfetto per il crioEM a singola particella ha portato a una vasta gamma di tecniche e apparecchiature in grado di congelare i campioni, tra cui robotica37,38, microfluidica42 e dispositivi ad ultrasuoni o a spruzzo27,39,40,41,42,43,44 . Negli ultimi anni, alcuni dei più diffusi dispositivi di preparazione dei campioni si affidano all’uso della robotica per il congelamento automatizzato dei campioni utilizzando la tecnica blot-and-plunge45. Mentre questi dispositivi sono progettati per creare in modo riproducibile uno spessore di ghiaccio adeguato per l’imaging, spesso rimangono troppo costosi per i singoli laboratori da acquistare e gestire e si trovano generalmente all’interno di strutture crioEM a tariffe orarie per l’uso. Negli ultimi anni, l’originale tecnica manuale blot-and-plunge è tornata in uso3,47,48,49,50,51,52. In effetti, un dispositivo blot-and-plunge azionato manualmente può ottenere griglie crioEM di alta qualità a una frazione del costo delle controparti robotiche. Inoltre, il blotting manuale offre anche un maggiore controllo degli utenti sul blotting in quanto i ricercatori possono regolare il tipo di blotting (ad esempio, back-blotting della griglia, front-blotting della griglia, ecc.) e il tempo di blotting in base a ogni singolo campione e domande di ricerca.
In questo articolo, forniamo dettagli su come congelare efficacemente i campioni biologici utilizzando un tradizionale dispositivo di vetrificazione manuale blot-and-plunge abbinato a una piattaforma dewar progettata su misura53. Vengono fornite le migliori pratiche, tra cui la preparazione del criogeno, la gestione della griglia, l’applicazione del campione e il blotting, nonché le insidie comuni e le raccomandazioni su come superare questi ostacoli. Vengono discussi consigli su come aumentare la riproducibilità dello spessore del ghiaccio tra i preparati a griglia e su come modificare il blotting del campione in base al tipo di campione biologico. Dato il basso costo associato all’acquisto e al funzionamento dello stantuffo manuale descritto in questo manoscritto, i laboratori di tutto il mondo possono preparare campioni biologici per il crioEM in modo economico e riproducibile.
Protocol
Representative Results
Discussion
La vitrificazione di campioni biologici per l’imaging mediante microscopia elettronica criogenica a singola particella (cryoEM) rimane un passo di fondamentale importanza per il successo della determinazione della struttura. Il metodo manuale blot-and-plunge descritto in questo protocollo rappresenta un metodo economico, affidabile e robusto per congelare rapidamente campioni biologici in film sottili di ghiaccio vitreo per l’imaging crioEM. Utilizzando i metodi descritti nel manoscritto, i ricercatori saranno in grado d…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo i membri del laboratorio Herzik per aver pensato criticamente e per aver fornito feedback su questo manoscritto e sul contenuto del video. M.A.H.Jr. è supportato da NIH R35 GM138206 e come Searle Scholar. H.P.M.N è supportato dal Molecular Biophysics Training Grant (NIH T32 GM008326). Vorremmo anche ringraziare Bill Anderson, Charles Bowman e il Dr. Gabriel Lander dello Scripps Research Institute per l’aiuto nella progettazione, assemblaggio e test dello stantuffo manuale mostrato nel video.
Materials
| 4 slot grid storage box | Ted Pella | 160-40 | |
| 14 gauge flat metal dispensing tip | Amazon | B07M7YWWLT | |
| 22×22 mm square glass coverslip | Sigma | C9802-1PAK | |
| 60 mm glass Petri dish to store grids | Fisher | 08-747A | |
| 100 mm glass Petri dish to store Whatman paper | Fisher | 08-747D | |
| 150 mm glass Petri dish to store Whatman paper | Fisher | 08-747F | |
| 250 mL beaker | Fisher | 02-555-25B | |
| Blue styrofoam dewar | Spear Lab | FD-500 | |
| Brass ethane vessel | Lasco | 17-4075 | |
| Clamping tweezers | Ted Pella | 38825 | |
| Delicate task wipes | Fisher | 06-666 | |
| Dual-stage regulator with control valve | Airgas | Y12N245D580-AG | |
| Dewer grid base | UCSD | ||
| Ethane platform | UCSD | ||
| Ethane propane tank | Praxair | ET PR50ZU-G | ethane (50%) : propane (50%) in a high-pressure tank |
| Ethane tank | Praxair | UN1035 | ethane (100%) |
| Flexible arm task light | Amscope | LED-11CR | |
| Grids (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 mesh) | Electron Microscopy Sciences | Q325AR1.3 | |
| Humidifier | Target | 719438 | |
| Hygrometer | ThermoPro | B01H1R0K68 | |
| Lab coat | UCSD | ||
| Liquid Nitrogen dewar | Worthington | LD4 | |
| Liquid Nitrogen gloves | Fisher | 19-059-925 | |
| Manual plunger stand (black stand + foot pedal) | UCSD | ||
| Mark 5 (plunging platform) | UCSD | ||
| Nitrile gloves | VWR | 82026-424 | |
| P20 pipette | Eppendorf | 13-690-029 | |
| PCR tubes | Eppendorf | E0030124286 | |
| Pipette tips | ibis scientific | 63300005 | |
| Ring lamp | Amazon | B07HMR4H8G | |
| Safety glasses | UCSD | ||
| Scissors | Amazon | Fiskars 01-004761J | |
| Screw driver | Ironside | 354711 | |
| Tape | Fisher | 15-901-10R | |
| Tweezer to transfer grid box | Amazon | LTS-3 | |
| Tygon tubing | Fisher | 14-171-130 | |
| Whatman blotting paper | Fisher | 1001-090 |
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