Stratégies d’inoculation pour infecter les racines des plantes avec des micro-organismes transmis par le sol
Summary
Ce protocole présente un résumé détaillé des stratégies pour inoculer les racines des plantes avec des microbes transmis par le sol. Exemple pour les champignons Verticillium longisporum et Verticillium dahliae, trois systèmes d’infection racinaire différents sont décrits. Les applications potentielles et les analyses en aval possibles sont mises en évidence, et les avantages ou les inconvénients sont discutés pour chaque système.
Abstract
La rhizosphère abrite une communauté microbienne très complexe dans laquelle les racines des plantes sont constamment remises en question. Les racines sont en contact étroit avec une grande variété de micro-organismes, mais les études sur les interactions dans le sol sont encore en retard sur celles effectuées sur les organes en surface. Bien que certaines stratégies d’inoculation pour infecter les plantes modèles avec des agents pathogènes racinaires modèles soient décrites dans la littérature, il reste difficile d’obtenir un aperçu méthodologique complet. Pour résoudre ce problème, trois systèmes d’inoculation racinaire différents sont décrits avec précision qui peuvent être appliqués pour mieux comprendre la biologie des interactions racine-microbe. À titre d’illustration, les espèces de Verticillium (à savoir , V. longisporum et V. dahliae) ont été utilisées comme agents pathogènes modèles envahissant les racines. Cependant, les méthodes peuvent être facilement adaptées à d’autres microbes colonisateurs de racines – à la fois pathogènes et bénéfiques. En colonisant le xylème végétal, les champignons vasculaires transmis par le sol tels que Verticillium spp. présentent un mode de vie unique. Après l’invasion racinaire, ils se propagent par les vaisseaux du xylème par voie acropétale, atteignent la pousse et provoquent des symptômes de la maladie. Trois espèces végétales représentatives ont été choisies comme hôtes modèles : Arabidopsis thaliana, colza économiquement important (Brassica napus) et tomate (Solanum lycopersicum). Des protocoles étape par étape sont donnés. Des résultats représentatifs des tests de pathogénicité, des analyses transcriptionnelles des gènes marqueurs et des confirmations indépendantes par des constructions de rapporteurs sont présentés. En outre, les avantages et les inconvénients de chaque système d’inoculation sont discutés en profondeur. Ces protocoles éprouvés peuvent aider à fournir des approches pour les questions de recherche sur les interactions racine-microbe. Savoir comment les plantes font face aux microbes dans le sol est crucial pour développer de nouvelles stratégies visant à améliorer l’agriculture.
Introduction
Les sols naturels sont habités par un nombre étonnant de microbes qui peuvent être neutres, nocifs ou bénéfiques pour les plantes1. De nombreux agents pathogènes des plantes sont transmis par le sol, entourent les racines et attaquent l’organe souterrain. Ces micro-organismes appartiennent à une grande variété de clades : champignons, oomycètes, bactéries, nématodes, insectes et certains virus 1,2. Une fois que les conditions environnementales favorisent l’infection, les plantes sensibles deviennent malades et les rendements des cultures diminuent. Les effets du changement climatique, tels que le réchauffement de la planète et les conditions météorologiques extrêmes, augmenteront la proportion d’agents pathogènes des plantes transmis par le sol3. Par conséquent, il deviendra de plus en plus important d’étudier ces microbes destructeurs et leur impact sur la production de denrées alimentaires et d’aliments pour animaux, mais aussi sur les écosystèmes naturels. De plus, il y a des mutualistes microbiens dans le sol qui interagissent étroitement avec les racines et favorisent la croissance, le développement et l’immunité des plantes. Lorsqu’elles sont confrontées à des agents pathogènes, les plantes peuvent recruter activement des adversaires spécifiques dans la rhizosphère qui peuvent soutenir la survie de l’hôte en supprimant les agents pathogènes 4,5,6,7. Cependant, les détails mécanistes et les voies impliquées dans les interactions bénéfiques racine-microbe sont souvent encore inconnus6.
Il est donc essentiel d’élargir la compréhension générale des interactions racine-microbe. Des méthodes fiables d’inoculation des racines avec des micro-organismes transmis par le sol sont nécessaires pour effectuer des études de modèles et transférer les résultats à des applications agricoles. Les interactions bénéfiques dans le sol sont étudiées, par exemple, avec Serendipita indica (anciennement connu sous le nom de Piriformospora indica), Rhizobium spp. fixateur d’azote ou champignons mycorhiziens, tandis que les agents pathogènes des plantes connus dans le sol comprennent Ralstonia solanacearum, Phytophthora spp., Fusarium spp. et Verticillium spp.1. Ces deux derniers sont des genres fongiques qui sont répartis dans le monde entier et causent des maladies vasculaires2. Verticillium spp. (Ascomycota) peut infecter des centaines d’espèces végétales – principalement des dicotylédones, y compris des annuelles herbacées, des plantes vivaces ligneuses et de nombreuses plantes cultivées 2,8. Les hyphes de Verticillium pénètrent dans la racine et se développent à la fois intercellulairement et intracellulairement vers le cylindre central pour coloniser les vaisseaux du xylème 2,9. Dans ces vaisseaux, le champignon reste pendant la majeure partie de son cycle de vie. Comme la sève du xylème est pauvre en nutriments et transporte des composés de défense des plantes, le champignon doit s’adapter à cet environnement unique. Ceci est accompli par la sécrétion de protéines liées à la colonisation qui permettent à l’agent pathogène de survivre dans son hôte10,11. Après avoir atteint le système vasculaire racinaire, le champignon peut se propager dans les vaisseaux du xylème par voie acropétale jusqu’au feuillage, ce qui conduit à une colonisation systémique de l’hôte 9,12. À ce stade, la plante est affectée négativement dans la croissance 9,10,13. Par exemple, un retard de croissance et des feuilles jaunes se produisent ainsi qu’une sénescence prématurée 13,14,15,16.
Un membre de ce genre est Verticillium longisporum, qui est très adapté aux hôtes brassicacés, tels que le colza agronomiquement important, le chou-fleur et la plante modèle Arabidopsis thaliana12. Plusieurs études ont combiné V. longisporum et A. thaliana pour obtenir des connaissances approfondies sur les maladies vasculaires transmises par le sol et les réponses de défense racinaire qui en résultent 13,15,16,17. Des tests de susceptibilité simples peuvent être réalisés en utilisant le système modèle V. longisporum / A. thaliana et des ressources génétiques bien établies sont disponibles pour les deux organismes. Étroitement lié à V. longisporum est l’agent pathogène Verticillium dahliae. Bien que les deux espèces fongiques effectuent un style de vie vasculaire et un processus d’invasion similaires, leur efficacité de propagation des racines aux feuilles et les symptômes de la maladie provoquée chez A. thaliana sont différents: alors que V. longisporum induit généralement une sénescence précoce, l’infection à V. dahliae entraîne un flétrissement18. Récemment, un résumé méthodologique a présenté différentes stratégies d’inoculation racinaire pour infecter A. thaliana avec V. longisporum ou V. dahliae, aidant à planifier des configurations expérimentales19. Sur le terrain, V. longisporum cause parfois des dommages importants dans la production de colza12, tandis que V. dahliae a une très large gamme d’hôtes comprenant plusieurs espèces cultivées, telles que la vigne, la pomme de terre et la tomate8. Cela rend les deux agents pathogènes économiquement intéressants à étudier.
Ainsi, les protocoles suivants utilisent à la fois V. longisporum et V. dahliae comme agents pathogènes racines modèles pour illustrer les approches possibles pour les inoculations racinaires. Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), colza (Brassica napus) et tomate (Solanum lycopersicum) ont été choisis comme hôtes modèles. Des descriptions détaillées des méthodologies peuvent être trouvées dans le texte ci-dessous et la vidéo qui l’accompagne. Les avantages et les inconvénients de chaque système d’inoculation sont discutés. Dans l’ensemble, cette collection de protocoles peut aider à identifier une méthode appropriée pour des questions de recherche spécifiques dans le contexte des interactions racine-microbe.
Protocol
Representative Results
Discussion
En raison des énormes pertes de rendement causées par les phytopathogènes transmis par le sol1, une amélioration des stratégies agricoles ou des variétés de cultures est nécessaire. La compréhension limitée de la pathogenèse des maladies transmises par le sol entrave le développement de plantes plus résistantes. Les mécanismes pathologiques sous-jacents doivent être explorés, pour lesquels une plate-forme méthodologique robuste est nécessaire. Les procédures d’inoculation rapp…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Tim Iven et Jaqueline Komorek pour leurs travaux antérieurs sur ces méthodes, le groupe de Wolfgang Dröge-Laser (Département de biologie pharmaceutique, Université de Würzburg, Allemagne) pour avoir fourni l’équipement et les ressources nécessaires à ce travail, et Wolfgang Dröge-Laser ainsi que Philipp Kreisz (tous deux de l’Université de Würzburg) pour la relecture critique du manuscrit. Cette étude a été soutenue par la « Deutsche Forschungsgemeinschaft » (DFG, DR273/15-1,2).
Materials
| Agar (Gelrite) | Carl Roth | Nr. 0039 | all systems described require Gelrite |
| Arabidopsis thaliana wild-type | NASC stock | Col-0 (N1092) | |
| Autoclave | Systec | VE-100 | |
| BlattFlaeche | Datinf GmbH | BlattFlaeche | software to determine leaf areas |
| Brassica napus wild-type | see Floerl et al., 2008 | rapid-cycling rape | genome ACaacc |
| Cefotaxime sodium | Duchefa | C0111 | |
| Chicanery flask 500 mL | Duran Group / neoLab | E-1090 | Erlenmeyer flask with four baffles |
| Collection tubes 50 mL | Sarstedt | 62.547.254 | 114 x 28 mm |
| Czapek Dextrose Broth medium | Duchefa | C1714 | |
| Digital camera | Nikon | D3100 18-55 VR | |
| Exsiccator (Desiccator ) | Duran Group | 200 DN, 5.8 L | Seal with lid to hold chlorine gas |
| Fluorescence Microscope | Leica | Leica TCS SP5 II | |
| HCl | Carl Roth | P074.3 | |
| KNO3 | Carl Roth | P021.1 | ≥ 99 % |
| KOH | Carl Roth | 6751 | |
| Leukopor | BSN medical GmbH | 2454-00 AP | non-woven tape 2.5 cm x 9.2 m |
| MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) | Carl Roth | 4256.2 | Pufferan ≥ 99 % |
| MgSO4 | Carl Roth | T888.1 | Magnesiumsulfate-Heptahydrate |
| Murashige & Skoog medium (MS) | Duchefa | M0222 | MS including vitamins |
| NaClO | Carl Roth | 9062.1 | |
| Percival growth chambers | CLF Plant Climatics GmbH | AR-66L2 | |
| Petri-dishes | Sarstedt | 82.1473.001 | size ØxH: 92 × 16 mm |
| Plastic cups (500 mL, transparent) | Pro-pac, salad boxx | 5070 | size: 108 × 81 × 102 mm |
| Pleated cellulose filter | Hartenstein | FF12 | particle retention level 8–12 μm |
| poly klima growth chamber | poly klima GmbH | PK 520 WLED | |
| Potato Dextrose Broth medium | SIGMA Aldrich | P6685 | for microbiology |
| Pots | Pöppelmann GmbH | TO 7 D or TO 9,5 D | Ø 7 cm resp. Ø 9.5 cm |
| PromMYB51::YFP | see Poncini et al., 2017 | MYB51 reporter line | YFP (i.e. 3xmVenus with NLS) |
| Reaction tubes 2 mL | Sarstedt | 72.695.400 | PCR Performance tested |
| Rotary (orbital) shaker | Edmund Bühler | SM 30 C control | |
| Sand (bird sand) | Pet Bistro, Müller Holding | 786157 | |
| Soil | Einheitserde spezial | SP Pikier (SP ED 63 P) | |
| Solanum lycopersicum wild-type | see Chavarro-Carrero et al., 2021 | Type: Moneymaker | |
| Thoma cell counting chamber | Marienfeld | 642710 | depth 0.020 mm; 0.0025 mm2 |
| Ultrapure water (Milli-Q purified water) | MERK | IQ 7003/7005 | water obtained after purification |
| Verticillium dahliae | see Reusche et al., 2014 | isolate JR2 | |
| Verticillium longisporum | Zeise and von Tiedemann, 2002 | strain Vl43 |
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