Impfungsstrategien zur Infektion von Pflanzenwurzeln mit bodenbürtigen Mikroorganismen
Summary
Dieses Protokoll enthält eine detaillierte Zusammenfassung der Strategien zur Beimpfung von Pflanzenwurzeln mit bodenbürtigen Mikroben. Am Beispiel der Pilze Verticillium longisporum und Verticillium dahliae werden drei verschiedene Wurzelinfektionssysteme beschrieben. Mögliche Anwendungen und mögliche nachgelagerte Analysen werden aufgezeigt und Vor- oder Nachteile für jedes System diskutiert.
Abstract
Die Rhizosphäre beherbergt eine hochkomplexe mikrobielle Gemeinschaft, in der Pflanzenwurzeln ständig herausgefordert werden. Wurzeln stehen in engem Kontakt mit einer Vielzahl von Mikroorganismen, aber Studien über bodenbürtige Wechselwirkungen liegen immer noch hinter denen, die an oberirdischen Organen durchgeführt werden. Obwohl in der Literatur einige Impfstrategien zur Infektion von Modellpflanzen mit Modellwurzelpathogenen beschrieben werden, bleibt es schwierig, einen umfassenden methodischen Überblick zu erhalten. Um dieses Problem anzugehen, werden drei verschiedene Wurzelimpfsysteme genau beschrieben, die angewendet werden können, um Einblicke in die Biologie der Wurzel-Mikroben-Interaktionen zu gewinnen. Zur Veranschaulichung wurden Verticillium-Arten (nämlich V. longisporum und V. dahliae) als wurzeleindringende Modellpathogene verwendet. Die Methoden können jedoch leicht an andere wurzelbesiedelnde Mikroben angepasst werden – sowohl pathogene als auch nützliche. Durch die Besiedlung der Pflanze Xylem zeigen bodengetragene Gefäßpilze wie Verticillium spp. einen einzigartigen Lebensstil. Nach der Wurzelinvasion breiten sie sich über die Xylemgefäße akropetisch aus, erreichen den Spross und lösen Krankheitssymptome aus. Drei repräsentative Pflanzenarten wurden als Modellwirte ausgewählt: Arabidopsis thaliana, wirtschaftlich wichtiger Raps (Brassica napus) und Tomate (Solanum lycopersicum). Es werden Schritt-für-Schritt-Protokolle gegeben. Es werden repräsentative Ergebnisse von Pathogenitätsassays, transkriptionellen Analysen von Markergenen und unabhängigen Bestätigungen durch Reporterkonstrukte gezeigt. Darüber hinaus werden die Vor- und Nachteile jedes Impfsystems gründlich diskutiert. Diese bewährten Protokolle können dabei helfen, Ansätze für Forschungsfragen zu Wurzel-Mikroben-Interaktionen bereitzustellen. Zu wissen, wie Pflanzen mit Mikroben im Boden umgehen, ist entscheidend für die Entwicklung neuer Strategien zur Verbesserung der Landwirtschaft.
Introduction
Natürliche Böden werden von einer erstaunlichen Anzahl von Mikroben bewohnt, die neutral, schädlich oder vorteilhaft für Pflanzen sein können1. Viele Pflanzenpathogene werden durch den Boden übertragen, umgeben die Wurzeln und greifen das unterirdische Organ an. Diese Mikroorganismen gehören zu einer Vielzahl von Kladen: Pilze, Oomyceten, Bakterien, Nematoden, Insekten und einige Viren 1,2. Sobald die Umweltbedingungen eine Infektion begünstigen, werden anfällige Pflanzen krank und die Ernteerträge sinken. Die Auswirkungen des Klimawandels, wie die globale Erwärmung und Wetterextreme, werden den Anteil bodenbürtiger Pflanzenpathogeneerhöhen 3. Daher wird es immer wichtiger, diese zerstörerischen Mikroben und ihre Auswirkungen auf die Lebens- und Futtermittelproduktion, aber auch auf natürliche Ökosysteme zu untersuchen. Darüber hinaus gibt es mikrobielle Mutualisten im Boden, die eng mit den Wurzeln interagieren und das Wachstum, die Entwicklung und die Immunität der Pflanzen fördern. Wenn Pflanzen mit Krankheitserregern konfrontiert werden, können sie aktiv spezifische Gegner in der Rhizosphäre rekrutieren, die das Überleben des Wirts unterstützen können, indem sie Krankheitserreger unterdrücken 4,5,6,7. Mechanistische Details und Signalwege, die an vorteilhaften Wurzel-Mikroben-Interaktionen beteiligt sind, sind jedoch oft noch unbekannt6.
Es ist daher wichtig, das allgemeine Verständnis der Wurzel-Mikroben-Wechselwirkungen zu erweitern. Zuverlässige Methoden zur Beimpfung von Wurzeln mit bodenbürtigen Mikroorganismen sind notwendig, um Modellstudien durchzuführen und die Erkenntnisse in landwirtschaftliche Anwendungen zu überführen. Vorteilhafte Wechselwirkungen im Boden werden beispielsweise mit Serendipita indica (früher bekannt als Piriformospora indica), stickstoffbindendem Rhizobium spp. oder Mykorrhizapilzen untersucht, während bekannte bodenbürtige Pflanzenpathogene Ralstonia solanacearum, Phytophthora spp., Fusarium spp. und Verticillium spp.1 umfassen. Die beiden letzteren sind Pilzgattungen, die weltweit verbreitet sind und Gefäßerkrankungenverursachen 2. Verticillium spp. (Ascomycota) kann Hunderte von Pflanzenarten infizieren – hauptsächlich Dikotyledonen, einschließlich krautiger Einjähriger, holziger Stauden und vieler Kulturpflanzen 2,8. Hyphen von Verticillium treten in die Wurzel ein und wachsen sowohl interzellulär als auch intrazellulär in Richtung des zentralen Zylinders, um die Xylemgefäße zu besiedeln 2,9. In diesen Gefäßen bleibt der Pilz für den größten Teil seines Lebenszyklus. Da der Xylemsaft nährstoffarm ist und pflanzliche Abwehrstoffe trägt, muss sich der Pilz an diese einzigartige Umgebung anpassen. Dies wird durch die Sekretion von kolonisationsbezogenen Proteinen erreicht, die es dem Erreger ermöglichen, in seinem Wirt10,11 zu überleben. Nach Erreichen des Wurzelgefäßes kann sich der Pilz innerhalb der Xylemgefäße akropetal auf das Laub ausbreiten, was zu einer systemischen Besiedlung des Wirts 9,12 führt. Zu diesem Zeitpunkt ist die Pflanze im Wachstum 9,10,13 negativ beeinflusst. Zum Beispiel treten Wachstumsverzögerung und gelbe Blätter sowie vorzeitige Seneszenz13,14,15,16 auf.
Ein Mitglied dieser Gattung ist Verticillium longisporum, das stark an brassicaceous Wirte wie den agronomisch wichtigen Raps, Blumenkohl und die Modellpflanze Arabidopsis thaliana12 angepasst ist. Mehrere Studien kombinierten V. longisporum und A. thaliana, um umfangreiche Einblicke in bodenbürtige Gefäßerkrankungen und die daraus resultierenden Wurzelabwehrreaktionenzu gewinnen 13,15,16,17. Mit dem Modellsystem V. longisporum / A. thaliana können einfache Empfindlichkeitstests durchgeführt werden und für beide Organismen stehen gut etablierte genetische Ressourcen zur Verfügung. Eng verwandt mit V. longisporum ist der Erreger Verticillium dahliae. Obwohl beide Pilzarten einen ähnlichen vaskulären Lebensstil und Invasionsprozess durchführen, sind ihre Vermehrungseffizienz von den Wurzeln bis zu den Blättern und die hervorgerufenen Krankheitssymptome bei A. thaliana unterschiedlich: Während V. longisporum normalerweise eine frühe Seneszenz induziert, führt eine Infektion mit V. dahliae zu welken18. Kürzlich wurden in einer methodischen Zusammenfassung verschiedene Wurzelimpfstrategien zur Infektion von A. thaliana mit V. longisporum oder V. dahliae vorgestellt, die bei der Planung von Versuchsaufbauten helfen19. Auf dem Feld verursacht V. longisporum gelegentlich erhebliche Schäden in der Rapsproduktion12, während V. dahliae ein sehr breites Wirtsspektrum hat, das mehrere Kulturarten wie Weinrebe, Kartoffel und Tomate8 umfasst. Dies macht beide Krankheitserreger wirtschaftlich interessant zu untersuchende Modelle.
So verwenden die folgenden Protokolle sowohl V. longisporum als auch V. dahliae als Modell-Wurzelpathogene, um mögliche Ansätze für Wurzelimpfungen zu veranschaulichen. Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), Raps (Brassica napus) und Tomaten (Solanum lycopersicum) wurden als Musterwirte ausgewählt. Detaillierte Beschreibungen der Methoden finden Sie im folgenden Text und im dazugehörigen Video. Vor- und Nachteile für jedes Impfsystem werden diskutiert. Zusammengenommen kann diese Protokollsammlung helfen, eine geeignete Methode für spezifische Forschungsfragen im Kontext von Wurzel-Mikroben-Interaktionen zu identifizieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aufgrund der enormen Ertragseinbußen durch bodenbürtigePhytopathogene 1 ist eine Verbesserung der Anbaustrategien oder Nutzpflanzensorten erforderlich. Der begrenzte Einblick in die Pathogenese bodenbürtigerer Krankheiten behindert die Entwicklung resistenterer Pflanzen. Es müssen die zugrunde liegenden Pathomechanismen erforscht werden, für die eine robuste methodische Plattform erforderlich ist. Berichtete Impfverfahren haben gezeigt, dass multifaktorielle Ereignisse in Wurzel-Mikroben-Inte…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Tim Iven und Jaqueline Komorek für ihre bisherigen Arbeiten zu diesen Methoden, der Gruppe von Wolfgang Dröge-Laser (Institut für Pharmazeutische Biologie, Universität Würzburg) für die Bereitstellung der Ausrüstung und der Ressourcen, die für diese Arbeit benötigt werden, und Wolfgang Dröge-Laser sowie Philipp Kreisz (beide Universität Würzburg) für das kritische Korrekturlesen des Manuskripts. Diese Studie wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG, DR273/15-1,2) gefördert.
Materials
| Agar (Gelrite) | Carl Roth | Nr. 0039 | all systems described require Gelrite |
| Arabidopsis thaliana wild-type | NASC stock | Col-0 (N1092) | |
| Autoclave | Systec | VE-100 | |
| BlattFlaeche | Datinf GmbH | BlattFlaeche | software to determine leaf areas |
| Brassica napus wild-type | see Floerl et al., 2008 | rapid-cycling rape | genome ACaacc |
| Cefotaxime sodium | Duchefa | C0111 | |
| Chicanery flask 500 mL | Duran Group / neoLab | E-1090 | Erlenmeyer flask with four baffles |
| Collection tubes 50 mL | Sarstedt | 62.547.254 | 114 x 28 mm |
| Czapek Dextrose Broth medium | Duchefa | C1714 | |
| Digital camera | Nikon | D3100 18-55 VR | |
| Exsiccator (Desiccator ) | Duran Group | 200 DN, 5.8 L | Seal with lid to hold chlorine gas |
| Fluorescence Microscope | Leica | Leica TCS SP5 II | |
| HCl | Carl Roth | P074.3 | |
| KNO3 | Carl Roth | P021.1 | ≥ 99 % |
| KOH | Carl Roth | 6751 | |
| Leukopor | BSN medical GmbH | 2454-00 AP | non-woven tape 2.5 cm x 9.2 m |
| MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) | Carl Roth | 4256.2 | Pufferan ≥ 99 % |
| MgSO4 | Carl Roth | T888.1 | Magnesiumsulfate-Heptahydrate |
| Murashige & Skoog medium (MS) | Duchefa | M0222 | MS including vitamins |
| NaClO | Carl Roth | 9062.1 | |
| Percival growth chambers | CLF Plant Climatics GmbH | AR-66L2 | |
| Petri-dishes | Sarstedt | 82.1473.001 | size ØxH: 92 × 16 mm |
| Plastic cups (500 mL, transparent) | Pro-pac, salad boxx | 5070 | size: 108 × 81 × 102 mm |
| Pleated cellulose filter | Hartenstein | FF12 | particle retention level 8–12 μm |
| poly klima growth chamber | poly klima GmbH | PK 520 WLED | |
| Potato Dextrose Broth medium | SIGMA Aldrich | P6685 | for microbiology |
| Pots | Pöppelmann GmbH | TO 7 D or TO 9,5 D | Ø 7 cm resp. Ø 9.5 cm |
| PromMYB51::YFP | see Poncini et al., 2017 | MYB51 reporter line | YFP (i.e. 3xmVenus with NLS) |
| Reaction tubes 2 mL | Sarstedt | 72.695.400 | PCR Performance tested |
| Rotary (orbital) shaker | Edmund Bühler | SM 30 C control | |
| Sand (bird sand) | Pet Bistro, Müller Holding | 786157 | |
| Soil | Einheitserde spezial | SP Pikier (SP ED 63 P) | |
| Solanum lycopersicum wild-type | see Chavarro-Carrero et al., 2021 | Type: Moneymaker | |
| Thoma cell counting chamber | Marienfeld | 642710 | depth 0.020 mm; 0.0025 mm2 |
| Ultrapure water (Milli-Q purified water) | MERK | IQ 7003/7005 | water obtained after purification |
| Verticillium dahliae | see Reusche et al., 2014 | isolate JR2 | |
| Verticillium longisporum | Zeise and von Tiedemann, 2002 | strain Vl43 |
Referencias
- Mendes, R., Garbeva, P., Raaijmakers, J. M. The rhizosphere microbiome: significance of plant beneficial, plant pathogenic, and human pathogenic microorganisms. FEMS Microbiology Review. 37 (5), 634-663 (2013).
- Yadeta, K. A., Thomma, B. P. H. J. The xylem as battleground for plant hosts and vascular wilt pathogens. Frontiers in Plant Science. 4, 97 (2013).
- Delgado-Baquerizo, M., et al. The proportion of soil-borne pathogens increases with warming at the global scale. Nature Climate Change. 10 (6), 550-554 (2020).
- Berendsen, R. L., et al. Disease-induced assemblage of a plant-beneficial bacterial consortium. The ISME Journal. 12 (6), 1496-1507 (2018).
- Yuan, J., et al. Root exudates drive the soil-borne legacy of aboveground pathogen infection. Microbiome. 6 (1), 156 (2018).
- Liu, H., et al. Evidence for the plant recruitment of beneficial microbes to suppress soil-borne pathogens. New Phytologist. 229 (5), 2873-2885 (2021).
- Wang, H., Liu, R., You, M. P., Barbetti, M. J., Chen, Y. Pathogen biocontrol using plant growth-promoting bacteria (PGPR): role of bacterial diversity. Microorganisms. 9 (9), 1988 (2021).
- Inderbitzin, P., Subbarao, K. V. Verticillium systematics and evolution: how confusion impedes Verticillium wilt management and how to resolve it. Phytopathology. 104 (6), 564-574 (2014).
- Eynck, C., Koopmann, B., Grunewaldt-Stoecker, G., Karlowsky, P., von Tiedemann, A. Differential interactions of Verticillium longisporum und V. dahliae with Brassica napus with molecular and histological techniques. European Journal of Plant Pathology. 118 (3), 259-274 (2007).
- Floerl, S., et al. Defence reactions in the apoplastic proteome of oilseed rape (Brassica napus var. napus) attenuate Verticillium longisporum growth but not disease symptoms. BMC Plant Biology. 8, 129 (2008).
- Leonard, M., et al. Verticillium longisporum elicits media-dependent secretome responses with capacity to distinguish between plant-related environments. Frontiers in Microbiology. 11, 1876 (2020).
- Depotter, J. R. L., et al. Verticillium longisporum, the invisible threat to oilseed rape and other brassicaceous plant hosts. Molecular Plant Pathology. 17 (7), 1004-1016 (2016).
- Fröschel, C., et al. A gain-of-function screen reveals redundant ERF transcription factors providing opportunities for resistance breeding toward the vascular fungal pathogen Verticillium longisporum. Molecular Plant-Microbe Interactions. 32 (9), 1095-1109 (2019).
- Zhou, L., Hu, Q., Johansson, A., Dixelius, C. Verticillium longisporum and V. dahliae: infection and disease in Brassica napus. Plant Pathology. 55 (1), 137-144 (2006).
- Ralhan, A., et al. The vascular pathogen Verticillium longisporum requires a jasmonic acid-independent COI1 function in roots to elicit disease symptoms in Arabidopsis shoots. Plant Physiology. 159 (3), 1192-1203 (2012).
- Reusche, M., et al. Stabilization of cytokinin levels enhances Arabidopsis resistance against Verticillium longisporum. Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (8), 850-860 (2013).
- Iven, T., et al. Transcriptional activation and production of tryptophan-derived secondary metabolites in Arabidopsis roots contributes to the defense against the fungal vascular pathogen Verticillium longisporum. Molecular Plant. 5 (6), 1389-1402 (2012).
- Reusche, M., et al. Infections with the vascular pathogens Verticillium longisporum and Verticillium dahliae induce distinct disease symptoms and differentially affect drought stress tolerance of Arabidopsis thaliana. Environmental and Experimental Botany. 108, 23-37 (2014).
- Fröschel, C. In-depth evaluation of root infection systems using the vascular fungus Verticillium longisporum as soil-borne model pathogen. Plant Methods. 17 (1), 57 (2021).
- Karapapa, V. K., Bainbridge, B. W., Heale, J. B. Morphological and molecular characterization of Verticillium longisporum comb, nov., pathogenic to oilseed rape. Mycological Research. 101 (11), 1281-1294 (1997).
- Poncini, L., et al. In roots of Arabidopsis thaliana, the damage-associated molecular pattern AtPep1 is a stronger elicitor of immune signalling than flg22 or the chitin heptamer. PLoS One. 12 (10), 1-21 (2017).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Fradin, E. F., et al. Genetic dissection of Verticillium wilt resistance mediated by tomato Ve1. Plant Physiology. 150 (1), 320-332 (2009).
- Singh, S., et al. The plant host Brassica napus induces in the pathogen Verticillium longisporum the expression of functional catalase peroxidase which is required for the late phase of disease. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (4), 569-581 (2012).
- Zeise, K., von Tiedemann, A. Application of RAPD-PCR for virulence type analysis within Verticillium dahliae and Verticillium longisporum. Journal of Phytopathology. 150 (10), 557-563 (2002).
- Fröschel, C., et al. Plant roots employ cell-layer-specific programs to respond to pathogenic and beneficial microbes. Cell Host & Microbe. 29 (2), 299-310 (2021).
- Gigolashvili, T., et al. The transcription factor HIG1/MYB51 regulates indolic glucosinolate biosynthesis in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 50 (5), 886-901 (2007).
- Back, M. A., Haydock, P. P. J., Jenkinson, P. Disease complexes involving plant parasitic nematodes and soilborne pathogens. Plant Pathology. 51 (6), 683-697 (2002).
- Behrens, F. H., et al. Suppression of abscisic acid biosynthesis at the early infection stage of Verticillium longisporum in oilseed rape (Brassica napus). Molecular Plant Pathology. 20 (12), 1645-1661 (2019).
- Vorholt, J. A., Vogel, C., Carlström, C. I., Müller, D. B. Establishing causality: opportunities of synthetic communities for plant microbiome research. Cell Host & Microbe. 22 (2), 142-155 (2017).
