식물 뿌리를 토양 매개 미생물로 감염시키는 접종 전략
Summary
이 프로토콜은 식물 뿌리에 토양 매개 미생물을 접종하는 전략에 대한 자세한 요약을 제공합니다. 진균 Verticillium longisporum 및 Verticillium dahliae에 대해 예시된 세 가지 상이한 뿌리 감염 시스템이 기술된다. 잠재적 응용 분야와 가능한 다운스트림 분석이 강조되고 각 시스템에 대한 장단점이 논의됩니다.
Abstract
근권은 식물 뿌리가 끊임없이 도전받는 매우 복잡한 미생물 공동체를 가지고 있습니다. 뿌리는 다양한 미생물과 밀접한 접촉을하지만, 토양 매개 상호 작용에 대한 연구는 여전히 지상 기관에서 수행 된 연구 뒤에 있습니다. 모델 뿌리 병원균으로 모델 식물을 감염시키기 위한 일부 접종 전략이 문헌에 기술되어 있지만, 포괄적인 방법론적 개요를 얻는 것은 여전히 어렵다. 이 문제를 해결하기 위해, 뿌리-미생물 상호작용의 생물학에 대한 통찰을 얻기 위해 적용될 수 있는 세 가지 상이한 뿌리 접종 시스템이 정확하게 기술된다. 예를 들어, Verticillium 종 (즉, V. longisporum 및 V. dahliae)은 뿌리 침입 모델 병원균으로 사용되었습니다. 그러나, 상기 방법은 병원성 및 유익한 미생물 둘 다의 다른 뿌리 식민지화에 쉽게 적응될 수 있다. 식물 자일렘을 식민지화함으로써, Verticillium spp.와 같은 혈관 토양 매개 진균은 독특한 생활 방식을 나타낸다. 뿌리 침범 후, 그들은 자일렘 혈관을 통해 작물 적으로 퍼지고, 싹에 도달하고, 질병 증상을 유발합니다. 세 가지 대표적인 식물 종들이 모델 숙주로 선택되었다: 애기장대 탈리아나, 경제적으로 중요한 오일시드 유채(브라시카 나푸스), 토마토(솔라눔 리코페르시쿰). 단계별 프로토콜이 제공됩니다. 병원성 분석, 마커 유전자의 전사 분석 및 리포터 구축물에 의한 독립적 확인의 대표적인 결과가 제시된다. 또한, 각 접종 시스템의 장점과 단점이 철저히 논의됩니다. 이러한 입증 된 프로토콜은 뿌리 – 미생물 상호 작용에 대한 연구 질문에 대한 접근 방식을 제공하는 데 도움이 될 수 있습니다. 식물이 토양의 미생물에 어떻게 대처하는지 아는 것은 농업을 개선하기위한 새로운 전략을 개발하는 데 중요합니다.
Introduction
자연 토양에는 식물에 중성, 유해 또는 유익 할 수있는 놀라운 수의 미생물이 서식합니다1. 많은 식물 병원균은 토양에서 태어나 뿌리를 둘러싸고 지하 기관을 공격합니다. 이 미생물은 곰팡이, oomycetes, 박테리아, 선충류, 곤충 및 일부 바이러스 1,2와 같은 다양한 클래드에 속합니다. 환경 조건이 감염을 선호하면 감염되기 쉬운 식물이 병에 걸리고 작물 수확량이 감소합니다. 지구 온난화와 극심한 날씨와 같은 기후 변화의 영향은 토양 매개 식물 병원균의 비율을 증가시킬 것입니다3. 따라서 이러한 파괴적인 미생물과 그 미생물이 식량 및 사료 생산뿐만 아니라 자연 생태계에 미치는 영향을 연구하는 것이 점점 더 중요해질 것입니다. 또한 토양에는 뿌리와 밀접하게 상호 작용하고 식물의 성장, 발달 및 면역을 촉진하는 미생물 상호 주의자가 있습니다. 병원균에 직면했을 때, 식물은 병원 균 4,5,6,7을 억제함으로써 숙주 생존을 지원할 수있는 근권의 특정 상대를 적극적으로 모집 할 수 있습니다. 그러나 유익한 뿌리 – 미생물 상호 작용과 관련된 기계론적 세부 사항 및 경로는 종종 여전히 알려지지 않았습니다6.
따라서 뿌리 – 미생물 상호 작용에 대한 일반적인 이해를 넓히는 것이 필수적입니다. 토양 매개 미생물에 뿌리를 접종하기위한 신뢰할 수있는 방법은 모델 연구를 수행하고 그 결과를 농업 응용 분야로 옮기는 데 필요합니다. 토양에서의 유익한 상호작용은 예를 들어, 세렌디피타 인디카 (이전의 피리포르모스포라 인디카로 알려짐), 질소-고정 리조븀 spp., 또는 균류 진균과 함께 연구되는 반면, 공지된 토양 매개 식물 병원체는 랄스토니아 솔라나세아럼, 피토프토호라 spp., 푸사리움 spp., 및 Verticillium spp.1을 포함한다. 후자의 두 가지는 전 세계적으로 분포되어 혈관 질환을 일으키는 곰팡이 속입니다2. Verticillium spp. (Ascomycota)는 초본 연간, 우디 다년생 식물 및 많은 작물 식물 2,8을 포함하여 주로 dicotyledons의 수백 종의 식물을 감염시킬 수 있습니다. Verticillium의 Hyphae는 뿌리에 들어가서 자일렘 혈관을 식민지화하기 위해 중앙 실린더를 향해 세포 간 및 세포 내에서 모두 성장합니다 2,9. 이 혈관에서 곰팡이는 수명주기의 대부분을 유지합니다. 자일렘 수액은 영양이 부족하고 식물 방어 화합물을 운반하기 때문에 곰팡이는이 독특한 환경에 적응해야합니다. 이는 병원체가 그의 숙주10,11에서 생존할 수 있게 하는 콜로니화 관련 단백질의 분비에 의해 달성된다. 뿌리 혈관 조직에 도달 한 후, 곰팡이는 자일렘 혈관 내에서 단풍으로 작물 적으로 퍼질 수 있으며, 이는 숙주 9,12의 전신 식민지화로 이어진다. 이 시점에서 식물은 성장 9,10,13에 부정적인 영향을받습니다. 예를 들어, 기절과 노란 잎은 조기 노화13,14,15,16뿐만 아니라 발생합니다.
이 속의 한 구성원은 Verticillium longisporum으로, 농경학적으로 중요한 유채 유채, 콜리 플라워 및 모델 식물 애기장대 탈리아나12와 같은 황동 숙주에 매우 적합합니다. 몇몇 연구는 V. longisporum과 A. thaliana를 결합하여 토양 매개 혈관 질환과 그 결과 뿌리 방어 반응13,15,16,17에 대한 광범위한 통찰력을 얻었습니다. 간단한 감수성 검사는 V. longisporum / A. thaliana 모델 시스템을 사용하여 실현 될 수 있으며 잘 확립 된 유전 자원은 두 유기체 모두에 사용할 수 있습니다. V. longisporum과 밀접한 관련이있는 병원체는 Verticillium dahliae입니다. 두 곰팡이 종 모두 비슷한 혈관 생활 양식과 침윤 과정을 수행하지만, 뿌리에서 잎으로의 전파 효율과 A. thaliana의 유발 된 질병 증상은 다릅니다 : V. longisporum은 일반적으로 조기 노화를 유도하는 반면, V. dahliae 감염은 시들음18을 초래합니다. 최근에, 방법론적 요약은 A. thaliana를 V. longisporum 또는 V. dahliae로 감염시키기 위한 상이한 뿌리 접종 전략을 제시하여, 실험 셋업19를 계획하는 데 도움을 주었다. 현장에서 V. longisporum은 때때로 유채 유채 생산12에서 심각한 손상을 일으키는 반면, V. dahliae는 포도 나무, 감자 및 토마토8과 같은 여러 재배 종으로 구성된 매우 광범위한 숙주 범위를 가지고 있습니다. 이것은 두 병원균을 경제적으로 흥미로운 모델로 연구하게합니다.
따라서, 다음의 프로토콜은 뿌리 접종을 위한 가능한 접근법을 예시하기 위해 모델 뿌리 병원체로서 V. longisporum 및 V. dahliae 둘 다를 사용한다. 애기장대 (애기장대 탈리아나), 유채 유채 (브라시카 나푸스) 및 토마토 (솔라눔 리코 페르시쿰)가 모델 호스트로 선택되었습니다. 방법론에 대한 자세한 설명은 아래 텍스트와 함께 제공되는 비디오에서 찾을 수 있습니다. 각 접종 시스템에 대한 장점과 단점이 논의됩니다. 종합하면,이 프로토콜 수집은 뿌리 – 미생물 상호 작용의 맥락에서 특정 연구 질문에 적합한 방법을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
토양 매개 식물 병원균1로 인한 엄청난 수확량 손실로 인해 농업 전략 또는 작물 품종의 개선이 필요합니다. 토양 매개 질병의 발병기전에 대한 제한된 통찰력은 더 저항력이 강한 식물의 발달을 방해합니다. 근본적인 병리학 적 메커니즘을 탐구 할 필요가 있으며, 이를 위해서는 강력한 방법론 적 플랫폼이 필요합니다. 보고된 접종 절차는 뿌리-미생물 상호작용에서의 다인자 ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 Tim Iven과 Jaqueline Komorek이 이러한 방법에 대한 이전 연구, 볼프강 Dröge-Laser (독일 뷔르츠부르크 대학 제약 생물학과)가이 작업에 필요한 장비와 자원을 제공했으며, Wolfgang Dröge-Laser와 Philipp Kreisz (뷔르츠부르크 대학 모두)가 원고의 비판적 교정을 위해 인정합니다. 이 연구는 “Deutsche Forschungsgemeinschaft“(DFG, DR273/15-1,2)에 의해 뒷받침되었다.
Materials
| Agar (Gelrite) | Carl Roth | Nr. 0039 | all systems described require Gelrite |
| Arabidopsis thaliana wild-type | NASC stock | Col-0 (N1092) | |
| Autoclave | Systec | VE-100 | |
| BlattFlaeche | Datinf GmbH | BlattFlaeche | software to determine leaf areas |
| Brassica napus wild-type | see Floerl et al., 2008 | rapid-cycling rape | genome ACaacc |
| Cefotaxime sodium | Duchefa | C0111 | |
| Chicanery flask 500 mL | Duran Group / neoLab | E-1090 | Erlenmeyer flask with four baffles |
| Collection tubes 50 mL | Sarstedt | 62.547.254 | 114 x 28 mm |
| Czapek Dextrose Broth medium | Duchefa | C1714 | |
| Digital camera | Nikon | D3100 18-55 VR | |
| Exsiccator (Desiccator ) | Duran Group | 200 DN, 5.8 L | Seal with lid to hold chlorine gas |
| Fluorescence Microscope | Leica | Leica TCS SP5 II | |
| HCl | Carl Roth | P074.3 | |
| KNO3 | Carl Roth | P021.1 | ≥ 99 % |
| KOH | Carl Roth | 6751 | |
| Leukopor | BSN medical GmbH | 2454-00 AP | non-woven tape 2.5 cm x 9.2 m |
| MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) | Carl Roth | 4256.2 | Pufferan ≥ 99 % |
| MgSO4 | Carl Roth | T888.1 | Magnesiumsulfate-Heptahydrate |
| Murashige & Skoog medium (MS) | Duchefa | M0222 | MS including vitamins |
| NaClO | Carl Roth | 9062.1 | |
| Percival growth chambers | CLF Plant Climatics GmbH | AR-66L2 | |
| Petri-dishes | Sarstedt | 82.1473.001 | size ØxH: 92 × 16 mm |
| Plastic cups (500 mL, transparent) | Pro-pac, salad boxx | 5070 | size: 108 × 81 × 102 mm |
| Pleated cellulose filter | Hartenstein | FF12 | particle retention level 8–12 μm |
| poly klima growth chamber | poly klima GmbH | PK 520 WLED | |
| Potato Dextrose Broth medium | SIGMA Aldrich | P6685 | for microbiology |
| Pots | Pöppelmann GmbH | TO 7 D or TO 9,5 D | Ø 7 cm resp. Ø 9.5 cm |
| PromMYB51::YFP | see Poncini et al., 2017 | MYB51 reporter line | YFP (i.e. 3xmVenus with NLS) |
| Reaction tubes 2 mL | Sarstedt | 72.695.400 | PCR Performance tested |
| Rotary (orbital) shaker | Edmund Bühler | SM 30 C control | |
| Sand (bird sand) | Pet Bistro, Müller Holding | 786157 | |
| Soil | Einheitserde spezial | SP Pikier (SP ED 63 P) | |
| Solanum lycopersicum wild-type | see Chavarro-Carrero et al., 2021 | Type: Moneymaker | |
| Thoma cell counting chamber | Marienfeld | 642710 | depth 0.020 mm; 0.0025 mm2 |
| Ultrapure water (Milli-Q purified water) | MERK | IQ 7003/7005 | water obtained after purification |
| Verticillium dahliae | see Reusche et al., 2014 | isolate JR2 | |
| Verticillium longisporum | Zeise and von Tiedemann, 2002 | strain Vl43 |
Referencias
- Mendes, R., Garbeva, P., Raaijmakers, J. M. The rhizosphere microbiome: significance of plant beneficial, plant pathogenic, and human pathogenic microorganisms. FEMS Microbiology Review. 37 (5), 634-663 (2013).
- Yadeta, K. A., Thomma, B. P. H. J. The xylem as battleground for plant hosts and vascular wilt pathogens. Frontiers in Plant Science. 4, 97 (2013).
- Delgado-Baquerizo, M., et al. The proportion of soil-borne pathogens increases with warming at the global scale. Nature Climate Change. 10 (6), 550-554 (2020).
- Berendsen, R. L., et al. Disease-induced assemblage of a plant-beneficial bacterial consortium. The ISME Journal. 12 (6), 1496-1507 (2018).
- Yuan, J., et al. Root exudates drive the soil-borne legacy of aboveground pathogen infection. Microbiome. 6 (1), 156 (2018).
- Liu, H., et al. Evidence for the plant recruitment of beneficial microbes to suppress soil-borne pathogens. New Phytologist. 229 (5), 2873-2885 (2021).
- Wang, H., Liu, R., You, M. P., Barbetti, M. J., Chen, Y. Pathogen biocontrol using plant growth-promoting bacteria (PGPR): role of bacterial diversity. Microorganisms. 9 (9), 1988 (2021).
- Inderbitzin, P., Subbarao, K. V. Verticillium systematics and evolution: how confusion impedes Verticillium wilt management and how to resolve it. Phytopathology. 104 (6), 564-574 (2014).
- Eynck, C., Koopmann, B., Grunewaldt-Stoecker, G., Karlowsky, P., von Tiedemann, A. Differential interactions of Verticillium longisporum und V. dahliae with Brassica napus with molecular and histological techniques. European Journal of Plant Pathology. 118 (3), 259-274 (2007).
- Floerl, S., et al. Defence reactions in the apoplastic proteome of oilseed rape (Brassica napus var. napus) attenuate Verticillium longisporum growth but not disease symptoms. BMC Plant Biology. 8, 129 (2008).
- Leonard, M., et al. Verticillium longisporum elicits media-dependent secretome responses with capacity to distinguish between plant-related environments. Frontiers in Microbiology. 11, 1876 (2020).
- Depotter, J. R. L., et al. Verticillium longisporum, the invisible threat to oilseed rape and other brassicaceous plant hosts. Molecular Plant Pathology. 17 (7), 1004-1016 (2016).
- Fröschel, C., et al. A gain-of-function screen reveals redundant ERF transcription factors providing opportunities for resistance breeding toward the vascular fungal pathogen Verticillium longisporum. Molecular Plant-Microbe Interactions. 32 (9), 1095-1109 (2019).
- Zhou, L., Hu, Q., Johansson, A., Dixelius, C. Verticillium longisporum and V. dahliae: infection and disease in Brassica napus. Plant Pathology. 55 (1), 137-144 (2006).
- Ralhan, A., et al. The vascular pathogen Verticillium longisporum requires a jasmonic acid-independent COI1 function in roots to elicit disease symptoms in Arabidopsis shoots. Plant Physiology. 159 (3), 1192-1203 (2012).
- Reusche, M., et al. Stabilization of cytokinin levels enhances Arabidopsis resistance against Verticillium longisporum. Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (8), 850-860 (2013).
- Iven, T., et al. Transcriptional activation and production of tryptophan-derived secondary metabolites in Arabidopsis roots contributes to the defense against the fungal vascular pathogen Verticillium longisporum. Molecular Plant. 5 (6), 1389-1402 (2012).
- Reusche, M., et al. Infections with the vascular pathogens Verticillium longisporum and Verticillium dahliae induce distinct disease symptoms and differentially affect drought stress tolerance of Arabidopsis thaliana. Environmental and Experimental Botany. 108, 23-37 (2014).
- Fröschel, C. In-depth evaluation of root infection systems using the vascular fungus Verticillium longisporum as soil-borne model pathogen. Plant Methods. 17 (1), 57 (2021).
- Karapapa, V. K., Bainbridge, B. W., Heale, J. B. Morphological and molecular characterization of Verticillium longisporum comb, nov., pathogenic to oilseed rape. Mycological Research. 101 (11), 1281-1294 (1997).
- Poncini, L., et al. In roots of Arabidopsis thaliana, the damage-associated molecular pattern AtPep1 is a stronger elicitor of immune signalling than flg22 or the chitin heptamer. PLoS One. 12 (10), 1-21 (2017).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Fradin, E. F., et al. Genetic dissection of Verticillium wilt resistance mediated by tomato Ve1. Plant Physiology. 150 (1), 320-332 (2009).
- Singh, S., et al. The plant host Brassica napus induces in the pathogen Verticillium longisporum the expression of functional catalase peroxidase which is required for the late phase of disease. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (4), 569-581 (2012).
- Zeise, K., von Tiedemann, A. Application of RAPD-PCR for virulence type analysis within Verticillium dahliae and Verticillium longisporum. Journal of Phytopathology. 150 (10), 557-563 (2002).
- Fröschel, C., et al. Plant roots employ cell-layer-specific programs to respond to pathogenic and beneficial microbes. Cell Host & Microbe. 29 (2), 299-310 (2021).
- Gigolashvili, T., et al. The transcription factor HIG1/MYB51 regulates indolic glucosinolate biosynthesis in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 50 (5), 886-901 (2007).
- Back, M. A., Haydock, P. P. J., Jenkinson, P. Disease complexes involving plant parasitic nematodes and soilborne pathogens. Plant Pathology. 51 (6), 683-697 (2002).
- Behrens, F. H., et al. Suppression of abscisic acid biosynthesis at the early infection stage of Verticillium longisporum in oilseed rape (Brassica napus). Molecular Plant Pathology. 20 (12), 1645-1661 (2019).
- Vorholt, J. A., Vogel, C., Carlström, C. I., Müller, D. B. Establishing causality: opportunities of synthetic communities for plant microbiome research. Cell Host & Microbe. 22 (2), 142-155 (2017).
