Estratégias de inoculação para infectar raízes vegetais com microrganismos transportados pelo solo
Summary
Este protocolo apresenta um resumo detalhado das estratégias para inocular raízes vegetais com micróbios transportados pelo solo. Exemplificados para os fungos Verticillium longisporum e Verticillium dahliae, três diferentes sistemas de infecção radicular são descritos. Potenciais aplicações e possíveis análises a jusante são destacadas, e vantagens ou desvantagens são discutidas para cada sistema.
Abstract
A rizosfera abriga uma comunidade microbiana altamente complexa na qual as raízes das plantas são constantemente desafiadas. As raízes estão em contato próximo com uma grande variedade de microrganismos, mas estudos sobre interações transmitidas pelo solo ainda estão por trás daqueles realizados em órgãos acima do solo. Embora algumas estratégias de inoculação para infectar plantas modelo com patógenos radiculares modelos sejam descritas na literatura, ainda é difícil obter uma visão geral metodológica abrangente. Para resolver esse problema, três diferentes sistemas de inoculação radicular são precisamente descritos que podem ser aplicados para obter insights sobre a biologia das interações root-micróbios. Para ilustração, as espécies de Verticillium (ou seja, V. longisporum e V. dahliae) foram empregadas como patógenos de modelo invasores radiculares. No entanto, os métodos podem ser facilmente adaptados a outros micróbios colonizadores radiculares – tanto patogênicos quanto benéficos. Ao colonizar a planta xilema, fungos vasculares transmitidos pelo solo, como Verticillium spp. exibem um estilo de vida único. Após a invasão radicular, eles se espalham pelos vasos xilema acropetalmente, chegam ao tiro e provocam sintomas da doença. Três espécies representativas de plantas foram escolhidas como hospedeiras-modelo: Arabidopsis thaliana, estupro de oleosa economicamente importante (Brassica napus) e tomate (Solanum lycopersicum). Protocolos passo a passo são dados. Resultados representativos de ensaios de patogenicidade, análises transcritivas de genes marcadores e confirmações independentes por construções de repórteres são mostrados. Além disso, as vantagens e desvantagens de cada sistema de inoculação são exaustivamente discutidas. Esses protocolos comprovados podem auxiliar no fornecimento de abordagens para perguntas de pesquisa sobre interações entre micróbios radiculares. Saber como as plantas lidam com micróbios no solo é crucial para o desenvolvimento de novas estratégias para melhorar a agricultura.
Introduction
Solos naturais são habitados por um número surpreendente de micróbios que podem ser neutros, prejudiciais ou benéficos para as plantas1. Muitos patógenos vegetais são transportados pelo solo, cercam as raízes e atacam o órgão subterrâneo. Esses microrganismos pertencem a uma grande variedade de clados: fungos, oomycetes, bactérias, nematoides, insetos e alguns vírus 1,2. Uma vez que as condições ambientais favoreçam a infecção, as plantas suscetíveis se tornarão doentes e a produção de culturas diminuirá. Os efeitos das mudanças climáticas, como o aquecimento global e os extremos climáticos, aumentarão a proporção de patógenos vegetais transportados pelo solo3. Portanto, será cada vez mais importante estudar esses micróbios destrutivos e seu impacto na produção de alimentos e rações, mas também nos ecossistemas naturais. Além disso, há mutualistas microbianos no solo que interagem firmemente com raízes e promovem o crescimento, o desenvolvimento e a imunidade das plantas. Quando confrontadas com patógenos, as plantas podem recrutar ativamente oponentes específicos na rizosfera que podem suportar a sobrevivência do hospedeiro suprimindo patógenos 4,5,6,7. No entanto, detalhes mecanicistas e caminhos envolvidos em interações benéficas entre micróbios radiculares ainda são desconhecidos6.
É, portanto, essencial ampliar a compreensão geral das interações raiz-micróbios. Métodos confiáveis para inocular raízes com microrganismos transportados pelo solo são necessários para realizar estudos de modelo e transferir os achados para aplicações agrícolas. Interações benéficas no solo são estudadas, por exemplo, com serndipita indica (anteriormente conhecida como Piriformospora indica), fixação de nitrogênio Rhizobium spp., ou fungos micorrizais, enquanto os patógenos vegetais suportados pelo solo incluem Ralstonia solanacearum, Phytophthora spp., Fusarium spp., e Verticillium spp.1. Os dois últimos são gêneros fúngicos que são distribuídos globalmente e causam doenças vasculares2. Verticillium spp. (Ascomycota) pode infectar centenas de espécies vegetais – em grande parte dicotyledons, incluindo anuários herbáceos, perenes lenhosos e muitas plantasagrícolas 2,8. A hifa de Verticillium entra na raiz e cresce intercelularmente e intracelularmente em direção ao cilindro central para colonizar os vasos xilema 2,9. Nestes vasos, o fungo permanece durante a maior parte de seu ciclo de vida. Como a seiva de xilema é pobre em nutrientes e carrega compostos de defesa vegetal, o fungo deve se adaptar a este ambiente único. Isso é feito pela secreção de proteínas relacionadas à colonização que permitem que o patógeno sobreviva em seuhospedeiro 10,11. Depois de atingir a vasculatura raiz, o fungo pode se espalhar dentro dos vasos xilem acropetalmente para a folhagem, o que leva à colonização sistêmica do hospedeiro 9,12. Neste ponto, a planta é afetada negativamente no crescimentode 9,10,13. Por exemplo, a desnutrição e as folhas amarelas ocorrem, bem como a senescência prematura 13,14,15,16.
Um membro desse gênero é o Verticillium longisporum, que é altamente adaptado aos hospedeiros brassicaceos, como o estupro da oleosa agronomicamente importante, a couve-flor e a planta modelo Arabidopsis thaliana12. Vários estudos combinaram V. longisporum e A. thaliana para obter extensas percepções sobre doenças vasculares transmitidas pelo solo e as respostas de defesa raiz resultantes 13,15,16,17. Testes de suscetibilidade simples podem ser realizados usando o sistema modelo V. longisporum / A. thaliana e recursos genéticos bem estabelecidos estão disponíveis para ambos os organismos. Intimamente relacionado com V. longisporum é o patógeno Verticillium dahliae. Embora ambas as espécies fúngicas realizem um processo de vida vascular semelhante e de invasão, sua eficiência de propagação de raízes para folhas e os sintomas da doença provocada em A. thaliana são diferentes: enquanto V. longisporum geralmente induz senescência precoce, a infecção por V. dahliae resulta em murchar18. Recentemente, um resumo metodológico apresentou diferentes estratégias de inoculação radicular para infectar A. thaliana com V. longisporum ou V. dahliae, auxiliando no planejamento de configurações experimentais19. No campo, V. longisporum ocasionalmente causa danos significativos na produção de estupro da oleosa12, enquanto V. dahliae tem uma gama hospedeira muito ampla composta por várias espécies cultivadas, como videira, batata e tomate8. Isso torna ambos os modelos economicamente interessantes para estudar.
Assim, os protocolos a seguir usam v . longisporum e V. dahliae como patógenos radiculares modelo para exemplificar possíveis abordagens para inoculações radiculares. Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), estupro de oleosa (Brassica napus) e tomate (Solanum lycopersicum) foram escolhidos como hospedeiros modelo. Descrições detalhadas das metodologias podem ser encontradas no texto abaixo e no vídeo que acompanha. São discutidas vantagens e desvantagens para cada sistema de inoculação. Em conjunto, essa coleção de protocolos pode ajudar a identificar um método adequado para questões específicas de pesquisa no contexto de interações root-micróbios.
Protocol
Representative Results
Discussion
Devido às enormes perdas de rendimento causadas pelos fitopatógenos transportados pelo solo1, é necessária uma melhoria das estratégias agrícolas ou variedades de culturas. A visão limitada da patogênese das doenças transmitidas pelo solo dificulta o desenvolvimento de plantas mais resistentes. Os mecanismos subjacentes precisam ser explorados, para os quais uma plataforma metodológica robusta é necessária. Os procedimentos de inoculação relatados mostraram que eventos multifatoriais…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores reconhecem Tim Iven e Jaqueline Komorek por trabalhos anteriores sobre esses métodos, o grupo de Wolfgang Dröge-Laser (Departamento de Biologia Farmacêutica da Universidade de Würzburg, Alemanha) por fornecer os equipamentos e os recursos necessários para este trabalho, e Wolfgang Dröge-Laser, bem como Philipp Kreisz (ambos da Universidade de Würzburg) para a revisão crítica do manuscrito. Este estudo foi apoiado pela “Deutsche Forschungsgemeinschaft” (DFG, DR273/15-1,2).
Materials
| Agar (Gelrite) | Carl Roth | Nr. 0039 | all systems described require Gelrite |
| Arabidopsis thaliana wild-type | NASC stock | Col-0 (N1092) | |
| Autoclave | Systec | VE-100 | |
| BlattFlaeche | Datinf GmbH | BlattFlaeche | software to determine leaf areas |
| Brassica napus wild-type | see Floerl et al., 2008 | rapid-cycling rape | genome ACaacc |
| Cefotaxime sodium | Duchefa | C0111 | |
| Chicanery flask 500 mL | Duran Group / neoLab | E-1090 | Erlenmeyer flask with four baffles |
| Collection tubes 50 mL | Sarstedt | 62.547.254 | 114 x 28 mm |
| Czapek Dextrose Broth medium | Duchefa | C1714 | |
| Digital camera | Nikon | D3100 18-55 VR | |
| Exsiccator (Desiccator ) | Duran Group | 200 DN, 5.8 L | Seal with lid to hold chlorine gas |
| Fluorescence Microscope | Leica | Leica TCS SP5 II | |
| HCl | Carl Roth | P074.3 | |
| KNO3 | Carl Roth | P021.1 | ≥ 99 % |
| KOH | Carl Roth | 6751 | |
| Leukopor | BSN medical GmbH | 2454-00 AP | non-woven tape 2.5 cm x 9.2 m |
| MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) | Carl Roth | 4256.2 | Pufferan ≥ 99 % |
| MgSO4 | Carl Roth | T888.1 | Magnesiumsulfate-Heptahydrate |
| Murashige & Skoog medium (MS) | Duchefa | M0222 | MS including vitamins |
| NaClO | Carl Roth | 9062.1 | |
| Percival growth chambers | CLF Plant Climatics GmbH | AR-66L2 | |
| Petri-dishes | Sarstedt | 82.1473.001 | size ØxH: 92 × 16 mm |
| Plastic cups (500 mL, transparent) | Pro-pac, salad boxx | 5070 | size: 108 × 81 × 102 mm |
| Pleated cellulose filter | Hartenstein | FF12 | particle retention level 8–12 μm |
| poly klima growth chamber | poly klima GmbH | PK 520 WLED | |
| Potato Dextrose Broth medium | SIGMA Aldrich | P6685 | for microbiology |
| Pots | Pöppelmann GmbH | TO 7 D or TO 9,5 D | Ø 7 cm resp. Ø 9.5 cm |
| PromMYB51::YFP | see Poncini et al., 2017 | MYB51 reporter line | YFP (i.e. 3xmVenus with NLS) |
| Reaction tubes 2 mL | Sarstedt | 72.695.400 | PCR Performance tested |
| Rotary (orbital) shaker | Edmund Bühler | SM 30 C control | |
| Sand (bird sand) | Pet Bistro, Müller Holding | 786157 | |
| Soil | Einheitserde spezial | SP Pikier (SP ED 63 P) | |
| Solanum lycopersicum wild-type | see Chavarro-Carrero et al., 2021 | Type: Moneymaker | |
| Thoma cell counting chamber | Marienfeld | 642710 | depth 0.020 mm; 0.0025 mm2 |
| Ultrapure water (Milli-Q purified water) | MERK | IQ 7003/7005 | water obtained after purification |
| Verticillium dahliae | see Reusche et al., 2014 | isolate JR2 | |
| Verticillium longisporum | Zeise and von Tiedemann, 2002 | strain Vl43 |
Referencias
- Mendes, R., Garbeva, P., Raaijmakers, J. M. The rhizosphere microbiome: significance of plant beneficial, plant pathogenic, and human pathogenic microorganisms. FEMS Microbiology Review. 37 (5), 634-663 (2013).
- Yadeta, K. A., Thomma, B. P. H. J. The xylem as battleground for plant hosts and vascular wilt pathogens. Frontiers in Plant Science. 4, 97 (2013).
- Delgado-Baquerizo, M., et al. The proportion of soil-borne pathogens increases with warming at the global scale. Nature Climate Change. 10 (6), 550-554 (2020).
- Berendsen, R. L., et al. Disease-induced assemblage of a plant-beneficial bacterial consortium. The ISME Journal. 12 (6), 1496-1507 (2018).
- Yuan, J., et al. Root exudates drive the soil-borne legacy of aboveground pathogen infection. Microbiome. 6 (1), 156 (2018).
- Liu, H., et al. Evidence for the plant recruitment of beneficial microbes to suppress soil-borne pathogens. New Phytologist. 229 (5), 2873-2885 (2021).
- Wang, H., Liu, R., You, M. P., Barbetti, M. J., Chen, Y. Pathogen biocontrol using plant growth-promoting bacteria (PGPR): role of bacterial diversity. Microorganisms. 9 (9), 1988 (2021).
- Inderbitzin, P., Subbarao, K. V. Verticillium systematics and evolution: how confusion impedes Verticillium wilt management and how to resolve it. Phytopathology. 104 (6), 564-574 (2014).
- Eynck, C., Koopmann, B., Grunewaldt-Stoecker, G., Karlowsky, P., von Tiedemann, A. Differential interactions of Verticillium longisporum und V. dahliae with Brassica napus with molecular and histological techniques. European Journal of Plant Pathology. 118 (3), 259-274 (2007).
- Floerl, S., et al. Defence reactions in the apoplastic proteome of oilseed rape (Brassica napus var. napus) attenuate Verticillium longisporum growth but not disease symptoms. BMC Plant Biology. 8, 129 (2008).
- Leonard, M., et al. Verticillium longisporum elicits media-dependent secretome responses with capacity to distinguish between plant-related environments. Frontiers in Microbiology. 11, 1876 (2020).
- Depotter, J. R. L., et al. Verticillium longisporum, the invisible threat to oilseed rape and other brassicaceous plant hosts. Molecular Plant Pathology. 17 (7), 1004-1016 (2016).
- Fröschel, C., et al. A gain-of-function screen reveals redundant ERF transcription factors providing opportunities for resistance breeding toward the vascular fungal pathogen Verticillium longisporum. Molecular Plant-Microbe Interactions. 32 (9), 1095-1109 (2019).
- Zhou, L., Hu, Q., Johansson, A., Dixelius, C. Verticillium longisporum and V. dahliae: infection and disease in Brassica napus. Plant Pathology. 55 (1), 137-144 (2006).
- Ralhan, A., et al. The vascular pathogen Verticillium longisporum requires a jasmonic acid-independent COI1 function in roots to elicit disease symptoms in Arabidopsis shoots. Plant Physiology. 159 (3), 1192-1203 (2012).
- Reusche, M., et al. Stabilization of cytokinin levels enhances Arabidopsis resistance against Verticillium longisporum. Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (8), 850-860 (2013).
- Iven, T., et al. Transcriptional activation and production of tryptophan-derived secondary metabolites in Arabidopsis roots contributes to the defense against the fungal vascular pathogen Verticillium longisporum. Molecular Plant. 5 (6), 1389-1402 (2012).
- Reusche, M., et al. Infections with the vascular pathogens Verticillium longisporum and Verticillium dahliae induce distinct disease symptoms and differentially affect drought stress tolerance of Arabidopsis thaliana. Environmental and Experimental Botany. 108, 23-37 (2014).
- Fröschel, C. In-depth evaluation of root infection systems using the vascular fungus Verticillium longisporum as soil-borne model pathogen. Plant Methods. 17 (1), 57 (2021).
- Karapapa, V. K., Bainbridge, B. W., Heale, J. B. Morphological and molecular characterization of Verticillium longisporum comb, nov., pathogenic to oilseed rape. Mycological Research. 101 (11), 1281-1294 (1997).
- Poncini, L., et al. In roots of Arabidopsis thaliana, the damage-associated molecular pattern AtPep1 is a stronger elicitor of immune signalling than flg22 or the chitin heptamer. PLoS One. 12 (10), 1-21 (2017).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Fradin, E. F., et al. Genetic dissection of Verticillium wilt resistance mediated by tomato Ve1. Plant Physiology. 150 (1), 320-332 (2009).
- Singh, S., et al. The plant host Brassica napus induces in the pathogen Verticillium longisporum the expression of functional catalase peroxidase which is required for the late phase of disease. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (4), 569-581 (2012).
- Zeise, K., von Tiedemann, A. Application of RAPD-PCR for virulence type analysis within Verticillium dahliae and Verticillium longisporum. Journal of Phytopathology. 150 (10), 557-563 (2002).
- Fröschel, C., et al. Plant roots employ cell-layer-specific programs to respond to pathogenic and beneficial microbes. Cell Host & Microbe. 29 (2), 299-310 (2021).
- Gigolashvili, T., et al. The transcription factor HIG1/MYB51 regulates indolic glucosinolate biosynthesis in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 50 (5), 886-901 (2007).
- Back, M. A., Haydock, P. P. J., Jenkinson, P. Disease complexes involving plant parasitic nematodes and soilborne pathogens. Plant Pathology. 51 (6), 683-697 (2002).
- Behrens, F. H., et al. Suppression of abscisic acid biosynthesis at the early infection stage of Verticillium longisporum in oilseed rape (Brassica napus). Molecular Plant Pathology. 20 (12), 1645-1661 (2019).
- Vorholt, J. A., Vogel, C., Carlström, C. I., Müller, D. B. Establishing causality: opportunities of synthetic communities for plant microbiome research. Cell Host & Microbe. 22 (2), 142-155 (2017).
