マウスの頭蓋窓手術のためのロボットドリル開頭術による熱損傷の評価
Summary
頭蓋窓は、トランスジェニックマウスの生体内イメージングを可能にするために、遍在的に実装された外科的技術になっています。このプロトコルでは、頭蓋窓の半自動骨穴あけを実行し、外科医間のばらつきを減らし、熱血液脳関門の損傷を部分的に軽減するのに役立つ外科用ロボットの使用について説明しています。
Abstract
頭蓋窓手術は、多光子または他の生体内イメージング技術を使用して、生きたマウスの脳組織のイメージングを可能にします。ただし、手作業で開頭術を行う場合、脳組織に熱損傷が発生することが多く、これは本質的に手術ごとに異なり、個々の外科医の技術に依存する可能性があります。手術ロボットを導入することで、手術を標準化し、手術に伴う熱損傷を減らすことができます。この研究では、熱損傷を評価するために、ロボット掘削の3つの方法をテストしました:水平、ポイントごと、およびパルスポイントごと。水平掘削は連続掘削回路図を利用しますが、ポイントごとに頭蓋窓を囲むいくつかの穴を掘削します。パルス化されたポイントバイポイントは、「2秒オン、2秒オフ」の穴あけスキームを追加し、穴あけの合間に冷却を可能にします。静脈内注射されたEvans Blue(EB)染料の蛍光イメージングは脳組織の損傷を測定し、掘削現場の下に配置された熱電対は熱損傷を測定します。熱電対の結果は、水平(16.66°C±2.08°C)およびポイントバイポイント(18.69°C±1.75°C)グループと比較して、パルスポイントバイポイント(6.90°C±1.35°C)グループで温度変化が大幅に減少していることを示しています。同様に、パルスポイントバイポイントグループも、水平法と比較して頭蓋窓穿孔後のEBの存在が有意に少なく、脳内の血管への損傷が少ないことを示しています。したがって、パルスポイントバイポイントドリル法は、熱損傷を低減するための最適なスキームであるように思われます。ロボットドリルは、トレーニング、変動を最小限に抑え、熱損傷を減らすのに役立つ便利なツールです。研究室全体で多光子イメージングの使用が拡大するにつれて、結果の厳密さと再現性を向上させることが重要です。ここで取り上げる方法は、これらの手術ロボットをより適切に使用してこの分野をさらに前進させる方法を他の人に知らせるのに役立ちます。
Introduction
頭蓋窓は、生きている動物の皮質の直接視覚化とイメージングを可能にするために、神経科学、神経工学、および生物学の分野で広く使用されるようになりました1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 .トランスジェニックマウスと多光子イメージングの強力な組み合わせは、in vivo脳における回路活性および他の生物学的洞察に関する非常に貴重な洞察を提供した12、13、14、15、16、17、18。頭蓋骨に取り付けられた小型顕微鏡は、これらの機能をさらに拡張して、目覚めた、自由に動く動物の記録を可能にしました19。頭蓋窓を作成するプロセスでは、皮蓋骨を薄くするか完全に除去して、皮質20の上に透明なガラス片を固定するのに十分な大きさの開頭術を生成するためのパワードリルが必要です。ポリジメチルシロキサン(PDMS)および他のポリマーも頭蓋窓材料として試験されている9、21。最終的に、理想的な頭蓋窓は、その下の正常な内因性活動を変化または妨害しないものです。しかし、頭蓋窓の穿孔は下にある組織を悪化させ、脳の損傷、環境の混乱、および多光子イメージングの深さを閉塞する点まで髄膜に影響を与えることが一般に認められています22。結果として生じる神経炎症は、血液脳関門(BBB)の透過性から、インプラント部位23周辺のグリア細胞の活性化および動員に至るまで、幅広い効果を有する。したがって、より安全で再現性の高い頭蓋窓掘削法の特性評価は、一貫した画像品質と交絡因子の低減に不可欠です。
下にある組織への外傷を最小限に抑えるように注意が払われていますが、骨を掘削する行為は、脳に熱的および機械的摂動の両方を引き起こす可能性があります24,25。硬膜への偶発的なドリルの侵入による機械的外傷は、様々な程度の皮質損傷をさらに誘発し得る24。Shoffstallらによる研究では25、骨掘削による熱は、脳実質25にエバンスブルー(EB)染料が存在することによって示されるように、BBB透過性の増加をもたらしました。静脈内注射されたEB色素は、血流中の循環アルブミンに結合するため、通常、かなりの濃度で健康なBBBを通過しません。その結果、EB色素はBBB透過性26、27の感度マーカーとして一般的に使用されている。彼らの研究は、研究中のその後の生物学的後遺症に対するBBB透過性の影響を直接測定していませんでしたが、以前の研究では、BBB透過性を慢性的に埋め込まれた微小電極に対する神経炎症反応の増加および運動機能の変化と相関させています28。
研究の目的によっては、熱的および機械的損傷の大きさが実験誤差の原因となり、研究の厳密さと再現性に悪影響を与える可能性があります。頭蓋窓を製造するための引用された方法は数十あり、それぞれが異なる掘削装置、速度、技術、およびユーザーを使用しています1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11。Shoffstall et al.25は、加熱結果の観察された変動は、手で掘削する場合には制御できない他の側面の中でも、ドリルの適用力、送り速度、および適用角度の変動に起因すると報告しました25。自動掘削システムやその他の定位固定装置が再現性と結果の一貫性を向上させることができるという信念がありますが、公表された方法研究では、結果の1つとして温度またはBBB透過性を厳密に評価していません。したがって、頭蓋窓を生成するためのより再現性が高く一貫して適用される方法、および頭蓋窓の穴あけが下にある神経組織に与える影響を評価するために厳密に適用される方法が必要です。
この研究の焦点は、頭蓋窓の一貫した安全な掘削方法を決定および開発することです。頭蓋窓設置のための開頭術のサイズは、脳移植微小電極のための標準的な開頭術よりも有意に大きい。このような開頭術は、標準装置を使用する場合、単一のバリ穴で完了することができず、それによって、手作業で行う場合により多くの外科医間の技術のばらつきを導入する20。外科用掘削ロボットが現場に導入されていますが、広く採用されていません1,6,29。穴あけの自動化は、観察された試験間の変動に寄与する変数の制御を提供し、装置の使用が外科医間および外科医内の影響を減らすことができることを示唆しています。これは、頭蓋窓の配置に必要なより大きな開頭術の追加の困難を考えると、特に興味深いものです。掘削を自動化することによって提供される制御には明らかな利点があると考えることができますが、これらの機器の実装についてはほとんど評価されていません。目に見える病変は認められていないが5、EBを用いたより高感度な試験が望まれている。
ここで、BBB透過性は、定位固定装置座標のプログラミング、開頭術の計画/マッピング、およびドリルビットのルーティングされた経路を参照する掘削スタイルの選択(「ポイントごと」対「水平」)を可能にする、対応するソフトウェアを備えた市販の外科用穴あけロボットを使用して測定されます。最初に、8つの「シード」ポイントがドリルされ(図1A)、頭蓋窓の輪郭が描かれます。ここから、シード間のスペースは、「ポイントバイポイント」または「水平」ドリル法のいずれかを使用して切り取られます。「ポイントバイポイント」は垂直パイロットホールカット(CNCドリルプレスと同様)を実行し、「水平」は穴の輪郭を描く頭蓋窓の円周に沿って水平カットを実行します(CNCルーターに似ています)。両方の方法の結果は、頭蓋骨窓を明らかにするために取り除くことができる頭蓋骨の一部です。穴あけによる損傷を隔離するために、追加の損傷を避けるために、頭蓋窓は物理的に取り外されません。EB色素と蛍光イメージングの組み合わせを使用して、マウスで開頭術を行った後のBBB透過性を測定し、挿入された熱電対を使用して、穴あけ中の脳表面の温度を直接測定します(図1B、C)。以前の観察では、2秒間隔でのパルス掘削のオン/オフがドリル加熱25を緩和するのに十分であることが示されたため、手術ロボットの実験アプローチに組み込まれています。
提示された研究の目的は、開頭穿孔による熱損傷を評価する方法を実証することです。方法は自動掘削のコンテキストで提示されていますが、そのような方法は手動掘削スキームにも適用できます。これらの方法は、標準的な手順として採用する前に、機器および/または掘削スキームの使用を検証するために使用できます。
図1:実験的なパイプラインの概略図。 頭蓋窓手順後のEB定量のために動物が受けたプロセスを示す概略図。(A)脳定位固定装置フレームと手術ロボットドリルを備えたマウスの概略セットアップ。頭蓋窓の例は、シードポイント(緑)とエッジポイント(青)を持つ運動皮質の上に示されています。(B)灌流のセットアップには、動物全体に1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を注射して血液を除去し、続いて脳を抽出することが含まれます。(C)次に、脳をEB蛍光イメージングシステムチャンバーに入れて、エバンスブルー染料の蛍光イメージングを行います。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Protocol
Representative Results
Discussion
EB色素とイメージングの使用は簡単で迅速であり、新しい方法や技術のために脳の血管損傷を評価するのに役立ちます。手術ロボットを使用する場合でも、現在ラボで行われている方法を確認する場合でも、実験的治療の効果と外科的影響を分離し、動物福祉を改善するために、外科的方法を検証することが重要です。熱電対のセットアップは、加熱が発生しないことを確認するための穴あ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、メリットレビュー賞GRANT12418820(カパドナ)およびGRANTI01RX003420(ショフストール/カパドナ)、および米国(US)退役軍人省リハビリテーション研究開発サービスの研究キャリア科学者賞#GRANT12635707(カパドナ)によって部分的にサポートされました。さらに、この研究は、国立衛生研究所、国立神経障害および脳卒中研究所GRANT12635723(カパドナ)、および国立生物医学画像および生物工学研究所、T32EB004314(Capadona/Kirsch)によっても部分的にサポートされました。この資料は、助成金番号GRANT12635723の下で国立科学財団大学院研究フェローシップによってサポートされている研究に基づいています。この資料に記載されている意見、調査結果、結論または推奨事項は、著者のものであり、必ずしも国立科学財団の見解を反映しているわけではありません。
Materials
| 1x Phosphate Buffered Saline Type: Reagent |
VWR | MRGF-6235 | For Evans Blue dilution |
| Aura Software Type: Tool |
Spectral Instruments Imaging | Open access imaging processing software for Lumina imaging sytems | |
| Buprenorphine Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
| Carbide Drill Bit, 0.6mm (Robot Drill) Type: Tool |
Stoelting | 58640-1 | |
| Carprofen Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
| Cefazolin Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
| Evans Blue Dye Type: Reagent |
Millipore Sigma | E2129 | Reconstituted in 1x phosphate-buffered saline |
| Isoflurane Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
| IVIS Lumina II Type: Tool |
Perkin Elmer | CLS136334 | IVIS Lumina III currently in place of Lumina II on the market |
| Jenco Linearizing Thermometer Type: Tool |
Jenco | 765JF | For Thermocouple setup |
| Ketamine Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
| LivingImage Type: Tool |
Perkin Elmer | Software for IVIS Lumina III | |
| Marcaine Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
| Neurostar Software Type: Tool |
Stoelting | Comes with surgical robot purchase | |
| Physiosuite with MouseSTAT® Pulse Oximeter & Heart Rate Monitor Type: Tool |
Kent Scientific | PS-03 | Used to monitor vitals |
| PrismPlus mice Type: Animal |
Jackson Labortory | 031478, RRID:IMSR_JAX:031478, Male, ~8 months old | Animals used for the study |
| Stoelting Drill and Injection Robot for Motorized Stereotaxic Instruments Type: Tool |
Stoelting | 58640 | Main robotic drill with stereotaxic frame |
| Thermocouple Type: Tool |
TC Direct | 206-557 | For Thermocouple setup |
| USB-6008 Multifunction I/O DAQ Type: Tool |
National Instruments | USB-6008 | For Thermocouple setup |
| Xylazine Type: Drug |
Sourced from Animal Facility |
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