Avaliação do Dano Térmico da Craniotomia Robotizada para Cirurgia de Janela de Crânio em Camundongos

Summary

As janelas cranianas tornaram-se uma técnica cirúrgica onipresente para permitir imagens intravitais em camundongos transgênicos. Este protocolo descreve o uso de um robô cirúrgico que realiza perfuração óssea semi-automatizada de janelas cranianas e pode ajudar a reduzir a variabilidade cirurgião-cirurgião e mitigar parcialmente os danos da barreira térmica hematoencefálica.

Abstract

A cirurgia da janela craniana permite a obtenção de imagens de tecido cerebral em camundongos vivos com o uso de multifótons ou outras técnicas de imagem intravitais. No entanto, ao realizar qualquer craniotomia à mão, muitas vezes há dano térmico ao tecido cerebral, que é inerentemente variável de cirurgia para cirurgia e pode ser dependente da técnica individual do cirurgião. A implementação de um robô cirúrgico pode padronizar a cirurgia e levar a uma diminuição do dano térmico associado à cirurgia. Neste estudo, três métodos de perfuração robótica foram testados para avaliar o dano térmico: horizontal, ponto a ponto e pulsado ponto a ponto. A perfuração horizontal utiliza um esquema de perfuração contínua, enquanto a perfuração ponto a ponto faz vários furos que abrangem a janela craniana. O pulsado ponto a ponto adiciona um esquema de perfuração “2 s on, 2 s off” para permitir o resfriamento entre as perfurações. A imagem fluorescente do corante Azul de Evans (EB) injetado por via intravenosa mede os danos ao tecido cerebral, enquanto um termopar colocado sob o local de perfuração mede o dano térmico. Os resultados do termopar indicam uma diminuição significativa na mudança de temperatura no grupo pulsado ponto a ponto (6,90 °C ± 1,35 °C) em comparação com os grupos horizontal (16,66 °C ± 2,08 °C) e ponto a ponto (18,69 °C ± 1,75 °C). Da mesma forma, o grupo pulsado ponto a ponto também mostrou presença significativamente menor de EB após a perfuração da janela craniana em comparação com o método horizontal, indicando menos danos aos vasos sanguíneos no cérebro. Assim, um método de perfuração ponto a ponto pulsado parece ser o esquema ideal para reduzir o dano térmico. Uma furadeira robótica é uma ferramenta útil para ajudar a minimizar o treinamento, a variabilidade e reduzir os danos térmicos. Com a expansão do uso de imagens multifótons em laboratórios de pesquisa, é importante melhorar o rigor e a reprodutibilidade dos resultados. Os métodos abordados aqui ajudarão a informar outros sobre como usar melhor esses robôs cirúrgicos para avançar ainda mais no campo.

Introduction

As janelas cranianas tornaram-se utilizadas de forma ubíqua nos campos da neurociência, engenharia neural e biologia para permitir a visualização direta e a obtenção de imagens do córtex em animais vivos 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . A poderosa combinação de camundongos transgênicos e imagens de múltiplos fótons forneceu informações extremamente valiosas sobre a atividade do circuito e outros conhecimentos biológicos no cérebro in vivo 12,13,14,15,16,17,18. Microscópios em miniatura montados no crânio ampliaram ainda mais essas capacidades para permitir gravações em animais acordados e em movimento livre¹⁹. O processo de criação de uma janela craniana requer perfurações elétricas para afinar ou remover completamente o osso craniano para produzir craniotomias grandes o suficiente para fixar um pedaço de vidro transparente sobre o córtex²⁰. Polidimetilsiloxano (PDMS) e outros polímeros também têm sido testados como materiais de janela craniana ^9,21. Em última análise, a janela craniana ideal é aquela que não altera ou interfere com a atividade endógena normal por baixo. No entanto, é comumente aceito que a perfuração da janela craniana agrava o tecido subjacente, levando a danos ao cérebro, ruptura do ambiente e afetando meninges a ponto de ocluir a profundidade de imagens multifótons22. A neuroinflamação resultante tem uma ampla gama de efeitos que vão desde a permeabilidade da barreira hematoencefálica (BHE), até a ativação e recrutamento de células gliais ao redor do local do implante²³. Portanto, caracterizar métodos de perfuração de janela craniana mais seguros e reprodutíveis é crucial para uma qualidade de imagem consistente e redução dos fatores de confusão.

Enquanto se toma cuidado para minimizar o trauma no tecido subjacente, o ato de perfurar o osso tem o potencial de causar perturbações térmicas e mecânicas ao cérebro^24,25. O trauma mecânico decorrente da penetração acidental da broca na dura-máter pode induzir graus variados de lesão cortical²⁴. No estudo de Shoffstall et al.25, o calor da perfuração óssea resultou em aumento da permeabilidade à BHE, como indicado pela presença do corante Azul de Evans (EB) no parênquima cerebral ²⁵. O corante EB, injetado por via intravenosa, liga-se à albumina circulante na corrente sanguínea e, portanto, normalmente não atravessa um BBB saudável em concentrações apreciáveis. Como resultado, o corante EB é comumente usado como um marcador sensível da permeabilidade à BHE^26,27. Embora seu estudo não tenha medido diretamente o impacto da permeabilidade da BBB nas sequelas biológicas subsequentes em estudo, estudos anteriores correlacionaram a permeabilidade à BBB a uma resposta neuroinflamatória aumentada a microeletrodos implantados cronicamente e alterações na função motora²⁸.

Dependendo dos objetivos do estudo, a magnitude dos danos térmicos e mecânicos pode contribuir como fonte de erro experimental, afetando negativamente o rigor e a reprodutibilidade do estudo. Existem dezenas de métodos citados para a confecção de janelas cranianas, cada um utilizando diferentes equipamentos de perfuração, velocidades, técnicas e usuários 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. Shoffstall et ^al.25 relataram que a variação observada nos resultados de aquecimento foi atribuída à variabilidade na força aplicada, taxa de alimentação e ângulo de aplicação da broca, entre outros aspectos que não podem ser controlados durante a perfuração^manual25. Acredita-se que sistemas de perfuração automatizados e outros equipamentos estereotáxicos possam melhorar a reprodutibilidade e a consistência dos resultados, mas estudos de métodos publicados não avaliaram rigorosamente a temperatura ou a permeabilidade à BHE como um dos desfechos. Portanto, há necessidade de métodos mais reprodutíveis e consistentemente aplicados para produzir janelas cranianas, bem como métodos rigorosamente aplicados para avaliar o impacto da perfuração da janela craniana no tecido neural subjacente.

O foco deste estudo é determinar e desenvolver métodos de perfuração consistentes e seguros para janelas cranianas. O tamanho da craniotomia para instalação da janela craniana é significativamente maior do que as craniotomias padrão para microeletrodos implantados no cérebro. Tais craniotomias não podem ser completadas com um único orifício de broca quando se utiliza equipamento padrão, introduzindo maior variabilidade da técnica intercirurgião quando realizadas^{manualmente20}. Robôs de perfuração cirúrgica têm sido introduzidos no campo, mas ainda não têm sido amplamente adotados ^1,6,29. A automação da perfuração oferece controle sobre as variáveis que contribuem para a variação experimental-a-experimental, sugerindo que o uso do equipamento pode reduzir os efeitos inter e intra-cirurgião. Isso é de particular interesse dada a dificuldade adicional da craniotomia maior necessária para a colocação da janela craniana. Embora se possa supor que haja benefícios claros para o controle proporcionado pela automação da perfuração, há pouca avaliação da implementação desses equipamentos. Embora lesões visíveis não tenham sido^observadas5, o teste de maior sensibilidade com o uso da EB é desejado.

Aqui, a permeabilidade BBB é medida usando um robô de perfuração cirúrgica disponível comercialmente com software correspondente, que permite a programação de coordenadas estereotáxicas, planejamento/mapeamento de craniotomia e uma seleção de estilos de perfuração (“ponto-a-ponto” vs “horizontal”), referindo-se ao caminho roteado da broca. Inicialmente, são perfurados oito pontos de “semente” (Figura 1A), delineando a janela craniana. A partir daqui, o espaço entre as sementes é recortado usando o método de broca “ponto a ponto” ou “horizontal”. “Ponto a ponto” realiza cortes de furo piloto verticais (semelhante a uma prensa de perfuração CNC), enquanto “horizontal” realiza cortes horizontais ao longo da circunferência da janela craniana que delineia o furo (semelhante a um roteador CNC). O resultado para ambos os métodos é um pedaço de crânio que pode ser removido para revelar a janela craniana. Para isolar os danos da perfuração, a janela craniana não é removida fisicamente, de modo a evitar qualquer dano adicional. Uma combinação de corante EB acoplado a imagens fluorescentes é usada para medir a permeabilidade à BHB após a realização de craniotomias em camundongos, e um termopar inserido é usado para medir diretamente a temperatura da superfície cerebral durante a perfuração (Figura 1B,C). Observações anteriores indicaram que a perfuração pulsada liga/desliga com intervalos de 2 s foi suficiente para mitigar o aquecimento da broca²⁵ e, portanto, está incorporada à abordagem experimental para o robô cirúrgico.

A intenção do trabalho apresentado é demonstrar métodos de avaliação de danos térmicos decorrentes da perfuração de craniotomias. Embora os métodos sejam apresentados no contexto da perfuração automatizada, tais métodos também podem ser aplicados a esquemas de perfuração manual. Esses métodos podem ser usados para validar o uso de equipamentos e/ou esquemas de perfuração antes de adotar como procedimento padrão.

Figura 1: Esquema de pipeline experimental. Esquema demonstrando o processo a que os animais foram submetidos para quantificação da EB pós-janela craniana. (A) Configuração esquemática do mouse com a armação estereotáxica e broca robótica cirúrgica. Um exemplo de janela craniana é mostrada sobre o córtex motor com pontos de semente (verde) e pontos de borda (azul). (B) A configuração de perfusão inclui a injeção de 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) em todo o animal para remover qualquer sangue, seguida de extração do cérebro. (C) O cérebro é então colocado na câmara do sistema de imagem fluorescente EB para conduzir imagens fluorescentes no corante azul de Evans. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocol

Todos os procedimentos e práticas de cuidados com os animais foram revisados, aprovados e realizados de acordo com o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Louis Stokes Cleveland Department of Veterans Affairs Medical Center. 1. Configuração do hardware do robô cirúrgico Antes da cirurgia, siga o manual do robô cirúrgico (consulte Tabela de Materiais) e o guia para configurar o hardware e o software. Execute a calibração do qu…

Representative Results

Avaliação térmicaO potencial de dano térmico foi avaliado medindo-se a mudança de temperatura em relação à linha de base devido à perfuração usando métodos horizontal (Figura 2A), ponto a ponto (Figura 2B) e pulsado ponto a ponto (Figura 2C). A Figura 2D mostra o arranjo experimental para a obtenção de dados térmicos. Um tamanho de amostra de N = 4 janelas cranianas f…

Discussion

O uso de corante EB e imagens é simples, rápido e útil para avaliar o dano vascular no cérebro para novos métodos e técnicas. Seja usando um robô cirúrgico ou confirmando métodos atualmente feitos em laboratório, é importante validar métodos cirúrgicos para isolar os efeitos de tratamentos experimentais versus impacto cirúrgico e melhorar o bem-estar animal. Uma configuração de termopar também é útil na avaliação de métodos de perfuração para garantir que nenhum aquecimento ocorra. Sabe-se que o a…

Materials

1x Phosphate Buffered Saline Type: Reagent	VWR	MRGF-6235	For Evans Blue dilution
Aura Software Type: Tool	Spectral Instruments Imaging		Open access imaging processing software for Lumina imaging sytems
Buprenorphine Type: Drug	Sourced from Animal Facility
Carbide Drill Bit, 0.6mm (Robot Drill) Type: Tool	Stoelting	58640-1
Carprofen Type: Drug	Sourced from Animal Facility
Cefazolin Type: Drug	Sourced from Animal Facility
Evans Blue Dye Type: Reagent	Millipore Sigma	E2129	Reconstituted in 1x phosphate-buffered saline
Isoflurane Type: Drug	Sourced from Animal Facility
IVIS Lumina II Type: Tool	Perkin Elmer	CLS136334	IVIS Lumina III currently in place of Lumina II on the market
Jenco Linearizing Thermometer Type: Tool	Jenco	765JF	For Thermocouple setup
Ketamine Type: Drug	Sourced from Animal Facility
LivingImage Type: Tool	Perkin Elmer		Software for IVIS Lumina III
Marcaine Type: Drug	Sourced from Animal Facility
Neurostar Software Type: Tool	Stoelting		Comes with surgical robot purchase
Physiosuite with MouseSTAT® Pulse Oximeter & Heart Rate Monitor Type: Tool	Kent Scientific	PS-03	Used to monitor vitals
PrismPlus mice Type: Animal	Jackson Labortory	031478, RRID:IMSR_JAX:031478, Male, ~8 months old	Animals used for the study
Stoelting Drill and Injection Robot for Motorized Stereotaxic Instruments Type: Tool	Stoelting	58640	Main robotic drill with stereotaxic frame
Thermocouple Type: Tool	TC Direct	206-557	For Thermocouple setup
USB-6008 Multifunction I/O DAQ Type: Tool	National Instruments	USB-6008	For Thermocouple setup
Xylazine Type: Drug	Sourced from Animal Facility