Imagerie en direct des premiers progéniteurs cardiaques dans l’embryon de souris

Summary

Nous présentons un protocole détaillé pour la culture et l’imagerie d’embryons de souris qui permet l’imagerie 3D + temps des cellules progénitrices cardiaques. Cette boîte à outils vidéo aborde les compétences clés requises pour réussir l’imagerie en direct autrement difficile à acquérir à partir de publications textuelles.

Abstract

Les premières étapes du développement cardiaque impliquent des changements drastiques dans le comportement et la différenciation cellulaire. Alors que l’analyse d’embryons fixes permet d’étudier en détail des stades de développement spécifiques dans un instantané fixe, l’imagerie en direct capture des événements morphogénétiques dynamiques, tels que la migration cellulaire, les changements de forme et la différenciation, en imageant l’embryon au fur et à mesure de son développement. Cela complète l’analyse fixe et élargit la compréhension de la façon dont les organes se développent au cours de l’embryogenèse. Malgré ses avantages, l’imagerie en direct est rarement utilisée dans les modèles murins en raison de ses défis techniques. Les embryons précoces de souris sont sensibles lorsqu’ils sont cultivés ex vivo et nécessitent une manipulation efficace. Pour faciliter une utilisation plus large de l’imagerie en direct dans la recherche sur le développement de la souris, cet article présente un protocole détaillé pour la microscopie vivante à deux photons qui permet l’acquisition à long terme dans les embryons de souris. En plus du protocole, des conseils sont fournis sur la manipulation des embryons et l’optimisation de la culture. Cela aidera à comprendre les événements clés de l’organogenèse précoce de la souris, améliorant ainsi la compréhension de la biologie des progéniteurs cardiovasculaires.

Introduction

Le cœur se forme tôt au cours de l’embryogenèse pour commencer à pomper les nutriments vers l’embryon entier, tandis qu’il continue à se développer¹. Chez les embryons de souris, un jour et demi après le début de la gastrulation, un organe cardiaque rudimentaire s’assemble au pôle antérieur ^2,3. Au stade Early Streak (ES), les progéniteurs cardiaques de l’épiblaste pénètrent à travers la traînée primitive jusqu’à la couche mésodermique naissante ^4,5,6 et commencent à migrer vers le pôle antérieur^, où ils se différencient pour former le tube cardiaque primitif. Tout au long de ce processus, les premiers progéniteurs cardiaques subissent des réarrangements cellulaires, des transformations de forme et une différenciation, en plus de la migration⁷ (Figure 1).

Les premiers progéniteurs cardiaques attirent les chercheurs depuis près d’un siècle en raison de leur capacité remarquable à différencier et à construire un organe fonctionnel simultanément. Au cours des deux dernières décennies, l’analyse clonale et les modèles d’élimination conditionnelle ont montré que le développement cardiaque précoce implique des sources cellulaires distinctes dans un processus hautement dynamique ^8,9,10. Cependant, la structure 3D du tube cardiaque primitif et la nature dynamique de sa morphogenèse le rendent difficile à étudier (Figure 1), et nous sommes loin d’en comprendre toute la complexité¹¹.

Pour étudier ces processus cellulaires dynamiques, les méthodes d’imagerie en direct offrent maintenant un détail sans précédent 7,12,13,14. Dans le modèle murin, les approches en direct ont été essentielles pour interroger les sujets de développement qui sont difficiles à aborder par l’analyse statique 7,13,15. Alors que la culture ex vivo à long terme et les configurations de microscope robustes progressent rapidement^16,17, peu de chercheurs ont l’expertise nécessaire pour imager avec succès des embryons vivants. Bien que les publications papier fournissent suffisamment de détails techniques pour reproduire des expériences d’imagerie en direct, certaines compétences et astuces sont difficiles à saisir sans exemples visuels ou assistance entre pairs. Pour accélérer ce processus d’apprentissage et étendre l’utilisation de l’imagerie en direct parmi les laboratoires, nous avons assemblé un protocole vidéo (Figure 2) qui rassemble les compétences nécessaires pour effectuer une imagerie en direct sur des embryons de souris en phase gastrulée.

Figure 1 : Différenciation précoce des cellules progénitrices cardiaques dans l’embryon de souris depuis le début de la gastrulation jusqu’au stade précédant la formation primitive du tube cardiaque. Les cellules progénitrices cardiaques pénètrent dans le mésoderme peu après le début de la gastrulation, migrant vers le côté opposé de l’embryon. Le stade morphologique et le stade embryonnaire du jour (E) sont écrits au-dessus des diagrammes. Les flèches pointillées représentent la trajectoire de migration des progéniteurs primitifs du tube cardiaque pendant la gastrulation. Ce chiffre a été adapté de¹¹. Abréviations : ES = Early Streak; MS = Traînée moyenne; EHF = pli précoce de la tête. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Diagramme de flux de travail pour l’imagerie en direct des premiers progéniteurs cardiaques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Protocol

Toutes les procédures animales ont été approuvées par le Comité d’éthique de l’expérimentation animale du CNIC, par la Communauté de Madrid (référence PROEX 220/15) et conformes à la directive européenne 2010/63UE et à la recommandation 2007/526/CE concernant la protection des animaux utilisés à des fins expérimentales et à d’autres fins scientifiques, appliquées dans la loi espagnole en vertu du Real Decreto 1201/2005. Ce protocole comprend l’utilisation de deux mâl…

Representative Results

Nous avons utilisé le protocole pour visualiser l’activation de la signalisation NOTCH chez les progéniteurs cardiaques précoces sur le point de se différencier en cellules endothéliales au cours de la morphogenèse primitive du tube cardiaque. Pour cela, nous avons croisé des souris C57BL / 6-N de type sauvage avec des souris Tg (CBF: H2BVenus, +)18 pour obtenir des embryons signalant une activité NOTCH via la protéine fluorescente jaune Vénus. À E7.5, la fluorescence de Vénus est pr…

Discussion

Les premiers progéniteurs cardiaques s’organisent dans un tube cardiaque primitif qui commence à battre alors qu’il est encore en formation. Comprendre comment ce processus se déroule est essentiel pour identifier le large spectre des malformations cardiaques congénitales à des événements morphogénétiques spécifiques. Pour cela, l’imagerie en direct offre la possibilité d’étudier le développement embryonnaire normal et défectueux avec une résolution temporelle accrue. Ceci est particulièrement uti…

Materials

#55 Forceps	Dumont	11295-51
35 mm Dish with glass coverslip bottom 14 mm Diameter	Mattek	P35G-1.5-14-C
35 mm vise table	Grandado	SKU 8798771617573
50 mL tubes	BD Falcon	352070
Distilled water
DMEM – Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	11966025	with L-Glutamine, without Glucose, without Na Pyruvate
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	10438-026
Fluorescent reporter transgenic mice (Tg(CBF:H2BVenus,+)	JAX
Fluorobrite DMEM	ThermoFisher	A1896701	DMEM for live-cell imaging
High-vacuum silicone grease	Dow Corning	Z273554-1EA
Holder for wires	Perlen Pressen	pwb1
LSM 780 Upright microscope	Zeiss
MaiTai Deepsee far red pulsed-laser tuned at 980 nm	Spectra-Physics
Non Descanned Detectors equipped with the filter sets cyan-yellow (BP450-500/BP520-560), green-red (BP500-520/BP570-610) and yellow-red (BP520-560/BP645-710)	Zeiss
Obj: 20x water dipping 1.0 NA, long working distance	Zeiss
P1000 and P200 pipettes
Paraffin Oil	Nidacon	VNI0049
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15070-063	(the final concentration should be 50 μg/mL penicillin and 50 μg/mL streptomycin)
Petri dishes 35 mm x 10 mm	BD Falcon	351008
Pipette tips
Polymethyl methacrylate			Reused from old laboratory equipment
Rat Serum culture embryo, male rats SPRAGUE DAWLEY RjHan SD	Janvier Labs	9979
Set of 160 mm fines	RS PRO	541-6933
Standard 1.0 mm glass capillaries	Anima Lab	1B100F-3
Sterile 0.22 μm syringe filter	Corning	431218
Sterile 5 mL syringe	Fisher Scientific	15809152
Tungsten needles
Ultrasonic homogeniser (sonicator)	Bandelin	BASO_17021