マウス胚における初期心臓前駆細胞のライブイメージング

Summary

心臓前駆細胞の3D +時間イメージングを可能にするマウス胚培養およびイメージングのための詳細なプロトコルを提示します。このビデオツールキットは、テキストのみの出版物では習得が困難なライブイメージングを成功させるために必要な主要なスキルに対応しています。

Abstract

心臓発達の最初のステップは、細胞の挙動と分化の劇的な変化を意味します。固定胚の解析では、静止画のスナップショットで特定の発生段階を詳細に研究することができますが、ライブイメージングでは、胚の発達を画像化することで、細胞の移動、形状変化、分化などの動的な形態形成イベントをキャプチャします。これは固定分析を補完し、胚形成中に臓器がどのように発達するかについての理解を広げます。その利点にもかかわらず、ライブイメージングは、その技術的な課題のためにマウスモデルで使用されることはめったにありません。初期のマウス胚は、 ex vivo で培養すると敏感であり、効率的な取り扱いが必要です。マウス発生研究におけるライブイメージングの幅広い使用を促進するために、この論文は、マウス胚での長期取得を可能にする2光子ライブ顕微鏡の詳細なプロトコルを提示します。プロトコルに加えて、胚の取り扱いと培養の最適化に関するヒントが提供されます。これは、初期のマウス器官形成における重要なイベントを理解するのに役立ち、心血管前駆細胞生物学の理解を深めます。

Introduction

心臓は胚形成の初期に形成され、胚全体に栄養素を送り込み始めますが、発達を続けます¹。マウス胚では、原腸形成の開始から1日半後、初歩的な心臓器官が前極^2,3に集合する。初期ストリーク(ES)段階までに、エピブラストの心臓前駆細胞は原始ストリークを通って新生中胚葉層^4,5,6に侵入し、前極に移動し始め、そこで分化して原始心臓管を形成します。このプロセスを通して、初期の心臓前駆細胞は、遊走に加えて、細胞の再編成、形状転換、および分化を経験します⁷(図1)。

初期の心臓前駆細胞は、機能的な器官を同時に分化および構築する驚くべき能力により、ほぼ1世紀にわたって研究者を魅了してきました。過去20年間、クローン解析と条件付きノックアウトモデルは、初期の心臓発達が非常に動的なプロセスに異なる細胞源を関与させることを示しました^8,9,10。しかし、原始的な心臓管の3D構造とその形態形成の動的な性質は、研究を困難にし(図1)、その完全な複雑さを理解するにはほど遠い¹¹。

これらの動的な細胞プロセスを研究するために、ライブイメージング法は現在、前例のない詳細を提供します⁷、^12、13、14。マウスモデルでは、静的解析では対処が困難な発達トピックを調査するためのライブアプローチが鍵となっています^7,13,15。長期間の生体外培養と堅牢な顕微鏡セットアップは急速に進歩していますが^16,17、生きた胚のイメージングを成功させる専門知識を持っている研究者はほとんどいません。紙ベースの出版物は、ライブイメージング実験を再現するのに十分な技術的詳細を提供しますが、視覚的な例やピアツーピアの支援がなければ、一部のスキルやトリックを把握することは困難です。この学習プロセスを加速し、ラボ間でライブイメージングの使用を広めるために、原腸マウス胚でライブイメージングを実行するために必要なスキルを収集するビデオプロトコル(図2)を組み立てました。

図1:原腸形成の開始から原始的な心臓管形成前の段階までのマウス胚における心臓前駆細胞の早期分化。 心臓前駆細胞は原腸形成の開始直後に中胚葉に侵入し、胚の反対側に移動する。形態学的および胚の日(E)段階は、図の上に書かれています。破線の矢印は、原腸形成中の原始心臓管前駆細胞の移行軌跡を示しています。この図は¹¹から適応されました。略語:ES =初期のストリーク。MS =ミドルストリーク;EHF = 初期のヘッドフォールド。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:初期心臓前駆細胞のライブイメージングのワークフロー図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Protocol

すべての動物手順は、CNIC動物実験倫理委員会、マドリッド共同体(参照PROEX 220/15)によって承認され、Real Decreto 1201/2005に基づいてスペインの法律で施行された、実験およびその他の科学的目的で使用される動物の保護に関するEU指令2010/63EUおよび勧告2007/526/ECに準拠しています。 このプロトコルには、NOTCH活性Tg(CBF:H2BVenus,+)を報告する蛍光トランスジェニックマウス系統の2…

Representative Results

このプロトコルを使用して、原始心臓管形態形成中に内皮細胞に分化しようとしている初期の心臓前駆細胞におけるNOTCHシグナル伝達活性化を視覚化しました。そのために、野生型C57BL/6-NマウスとTg(CBF:H2BVenus,+)マウス18 を交配し、黄色蛍光タンパク質Venusを介してNOTCH活性を報告する胚を取得しました。E7.5では、金星蛍光は神経外胚葉全体に存在し、内臓および胚外中胚葉に…

Discussion

初期の心臓前駆細胞は、それがまだ形成されている間に鼓動を開始する原始的な心臓管で組織化します。このプロセスがどのように行われるかを理解することは、特定の形態形成イベントに対する先天性心疾患の広い範囲を特定するための鍵です。そのために、ライブイメージングは、時間分解能を高めて正常および欠陥のある胚発生を研究する機会を提供します。これは、初期の心臓前駆?…

Materials

#55 Forceps	Dumont	11295-51
35 mm Dish with glass coverslip bottom 14 mm Diameter	Mattek	P35G-1.5-14-C
35 mm vise table	Grandado	SKU 8798771617573
50 mL tubes	BD Falcon	352070
Distilled water
DMEM – Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	11966025	with L-Glutamine, without Glucose, without Na Pyruvate
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	10438-026
Fluorescent reporter transgenic mice (Tg(CBF:H2BVenus,+)	JAX
Fluorobrite DMEM	ThermoFisher	A1896701	DMEM for live-cell imaging
High-vacuum silicone grease	Dow Corning	Z273554-1EA
Holder for wires	Perlen Pressen	pwb1
LSM 780 Upright microscope	Zeiss
MaiTai Deepsee far red pulsed-laser tuned at 980 nm	Spectra-Physics
Non Descanned Detectors equipped with the filter sets cyan-yellow (BP450-500/BP520-560), green-red (BP500-520/BP570-610) and yellow-red (BP520-560/BP645-710)	Zeiss
Obj: 20x water dipping 1.0 NA, long working distance	Zeiss
P1000 and P200 pipettes
Paraffin Oil	Nidacon	VNI0049
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15070-063	(the final concentration should be 50 μg/mL penicillin and 50 μg/mL streptomycin)
Petri dishes 35 mm x 10 mm	BD Falcon	351008
Pipette tips
Polymethyl methacrylate			Reused from old laboratory equipment
Rat Serum culture embryo, male rats SPRAGUE DAWLEY RjHan SD	Janvier Labs	9979
Set of 160 mm fines	RS PRO	541-6933
Standard 1.0 mm glass capillaries	Anima Lab	1B100F-3
Sterile 0.22 μm syringe filter	Corning	431218
Sterile 5 mL syringe	Fisher Scientific	15809152
Tungsten needles
Ultrasonic homogeniser (sonicator)	Bandelin	BASO_17021