Imagem ao vivo de progenitores cardíacos precoces no embrião de camundongo

Summary

Apresentamos um protocolo detalhado para cultura e imagem de embriões de camundongos que permite imagens 3D + tempo de células progenitoras cardíacas. Este kit de ferramentas de vídeo aborda as principais habilidades necessárias para o sucesso da geração de imagens ao vivo, de outra forma difíceis de adquirir de publicações somente de texto.

Abstract

Os primeiros passos do desenvolvimento cardíaco implicam mudanças drásticas no comportamento e diferenciação celular. Enquanto a análise de embriões fixos permite estudar em detalhes estágios específicos de desenvolvimento em um instantâneo estático, a imagem ao vivo captura eventos morfogenéticos dinâmicos, como migração celular, mudanças de forma e diferenciação, por meio de imagens do embrião à medida que ele se desenvolve. Isso complementa a análise fixa e expande a compreensão de como os órgãos se desenvolvem durante a embriogênese. Apesar de suas vantagens, a imagem ao vivo raramente é usada em modelos de mouse por causa de seus desafios técnicos. Os embriões precoces de camundongos são sensíveis quando cultivados ex vivo e requerem manuseio eficiente. Para facilitar um uso mais amplo de imagens vivas em pesquisas de desenvolvimento de camundongos, este artigo apresenta um protocolo detalhado para microscopia viva de dois fótons que permite a aquisição a longo prazo em embriões de camundongos. Além do protocolo, são fornecidas dicas sobre manuseio de embriões e otimização da cultura. Isso ajudará a entender os principais eventos na organogênese precoce do camundongo, melhorando a compreensão da biologia do progenitor cardiovascular.

Introduction

O coração se forma cedo durante a embriogênese para começar a bombear nutrientes para todo o embrião, enquanto ele continua se desenvolvendo¹. Em embriões de camundongos, um dia e meio após o início da gastrulação, um órgão cardíaco rudimentar se reúne no polo anterior ^2,3. No estágio Early Streak (ES), os progenitores cardíacos no epiblasto ingressam através da estria primitiva para a camada mesodérmica nascente ^4,5,6 e começam a migrar para o polo anterior^, onde se diferenciam para formar o tubo cardíaco primitivo. Ao longo desse processo, os progenitores cardíacos precoces passam por rearranjos celulares, transformações de forma e diferenciação, além da migração⁷ (Figura 1).

Os primeiros progenitores cardíacos atraíram pesquisadores por quase um século devido à sua notável capacidade de diferenciar e construir um órgão funcional simultaneamente. Nas últimas duas décadas, a análise clonal e os modelos de knockout condicional mostraram que o desenvolvimento cardíaco precoce implica fontes celulares distintas em um processo altamente dinâmico ^8,9,10. No entanto, a estrutura 3D do tubo cardíaco primitivo e a natureza dinâmica de sua morfogênese o tornam difícil de estudar (Figura 1), e estamos longe de compreender toda a sua complexidade¹¹.

Para estudar esses processos celulares dinâmicos, os métodos de imagem ao vivo agora oferecem um detalhe sem precedentes ^7,12,13,14. No modelo de camundongos, as abordagens ao vivo têm sido fundamentais para interrogar tópicos de desenvolvimento que são difíceis de abordar pela análise estática 7,13,15. Embora a cultura ex vivo de longo prazo e as configurações robustas de microscópio estejam avançando rapidamente^16,17, poucos pesquisadores têm a experiência para obter imagens bem-sucedidas de embriões vivos. Embora as publicações baseadas em papel forneçam detalhes técnicos suficientes para reproduzir experimentos de imagem ao vivo, algumas habilidades e truques são difíceis de entender sem exemplos visuais ou assistência peer-to-peer. Para acelerar esse processo de aprendizagem e difundir o uso de imagens ao vivo entre os laboratórios, montamos um protocolo de vídeo (Figura 2) que reúne as habilidades necessárias para realizar imagens ao vivo em embriões de camundongos gastrulantes.

Figura 1: Diferenciação precoce das células progenitoras cardíacas no embrião de camundongo desde o início da gastrulação até o estágio que precede a formação primitiva do tubo cardíaco. As células progenitoras cardíacas entram no mesoderma logo após o início da gastrulação, migrando para o lado oposto do embrião. O estágio morfológico e embrionário do dia (E) é escrito em cima dos diagramas. As setas tracejadas retratam a trajetória de migração de progenitores primitivos do tubo cardíaco durante a gastrulação. Este número foi adaptado de¹¹. Abreviaturas: ES = Early Streak; MS = Estria Média; EHF = Early Head Fold. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Diagrama de fluxo de trabalho para imagens ao vivo dos primeiros progenitores cardíacos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocol

Todos os procedimentos em animais foram aprovados pelo Comité de Ética em Experimentação Animal da CNIC, pela Comunidade de Madrid (Referência PROEX 220/15) e em conformidade com a Diretiva da UE 2010/63UE e a Recomendação 2007/526/CE relativa à proteção dos animais utilizados para fins experimentais e outros fins científicos, aplicados na legislação espanhola ao abrigo do Real Decreto 1201/2005. Esse protocolo inclui o uso de dois machos da linhagem de camundongos transgênicos f…

Representative Results

Utilizamos o protocolo para visualizar a ativação da sinalização NOTCH em progenitores cardíacos precoces prestes a se diferenciar para células endoteliais durante a morfogênese primitiva do tubo cardíaco. Para isso, cruzamos camundongos do tipo selvagem C57BL/6-N com camundongos Tg (CBF:H2BVenus,+)18 para obter embriões relatando atividade NOTCH através da proteína fluorescente amarela Vênus. Em E7.5, a fluorescência de Vênus está presente em todo o ectoderma neural, com alguns nú…

Discussion

Os primeiros progenitores cardíacos se organizam em um tubo cardíaco primitivo que começa a bater enquanto ainda está se formando. Entender como esse processo ocorre é fundamental para identificar o amplo espectro de defeitos cardíacos congênitos para eventos morfogenéticos específicos. Para isso, a imagem ao vivo oferece uma oportunidade de estudar o desenvolvimento embrionário normal e defeituoso com maior resolução temporal. Isso é especialmente útil para estudar as células progenitoras cardíacas preco…

Materials

#55 Forceps	Dumont	11295-51
35 mm Dish with glass coverslip bottom 14 mm Diameter	Mattek	P35G-1.5-14-C
35 mm vise table	Grandado	SKU 8798771617573
50 mL tubes	BD Falcon	352070
Distilled water
DMEM – Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	11966025	with L-Glutamine, without Glucose, without Na Pyruvate
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	10438-026
Fluorescent reporter transgenic mice (Tg(CBF:H2BVenus,+)	JAX
Fluorobrite DMEM	ThermoFisher	A1896701	DMEM for live-cell imaging
High-vacuum silicone grease	Dow Corning	Z273554-1EA
Holder for wires	Perlen Pressen	pwb1
LSM 780 Upright microscope	Zeiss
MaiTai Deepsee far red pulsed-laser tuned at 980 nm	Spectra-Physics
Non Descanned Detectors equipped with the filter sets cyan-yellow (BP450-500/BP520-560), green-red (BP500-520/BP570-610) and yellow-red (BP520-560/BP645-710)	Zeiss
Obj: 20x water dipping 1.0 NA, long working distance	Zeiss
P1000 and P200 pipettes
Paraffin Oil	Nidacon	VNI0049
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15070-063	(the final concentration should be 50 μg/mL penicillin and 50 μg/mL streptomycin)
Petri dishes 35 mm x 10 mm	BD Falcon	351008
Pipette tips
Polymethyl methacrylate			Reused from old laboratory equipment
Rat Serum culture embryo, male rats SPRAGUE DAWLEY RjHan SD	Janvier Labs	9979
Set of 160 mm fines	RS PRO	541-6933
Standard 1.0 mm glass capillaries	Anima Lab	1B100F-3
Sterile 0.22 μm syringe filter	Corning	431218
Sterile 5 mL syringe	Fisher Scientific	15809152
Tungsten needles
Ultrasonic homogeniser (sonicator)	Bandelin	BASO_17021