Fare Embriyosundaki Erken Kardiyak Progenitörlerin Canlı Görüntülenmesi
Summary
Kardiyak progenitör hücrelerin 3D + zaman görüntülemesini sağlayan fare embriyo kültürü ve görüntülemesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu video araç seti, başarılı canlı görüntüleme için gereken temel becerileri ele alır, aksi takdirde yalnızca metin yayınlarından elde edilmesi zordur.
Abstract
Kalp gelişiminin ilk adımları, hücre davranışında ve farklılaşmasında ciddi değişiklikler anlamına gelir. Sabit embriyoların analizi, hareketsiz bir anlık görüntüde spesifik gelişim aşamalarının ayrıntılı olarak incelenmesine izin verirken, canlı görüntüleme, embriyoyu geliştikçe görüntüleyerek hücre göçü, şekil değişiklikleri ve farklılaşma gibi dinamik morfogenetik olayları yakalar. Bu, sabit analizi tamamlar ve embriyogenez sırasında organların nasıl geliştiğinin anlaşılmasını genişletir. Avantajlarına rağmen, canlı görüntüleme, teknik zorlukları nedeniyle fare modellerinde nadiren kullanılır. Erken fare embriyoları kültüre alındığında ex vivo hassastır ve verimli kullanım gerektirir. Fare gelişimsel araştırmalarında canlı görüntülemenin daha geniş bir kullanımını kolaylaştırmak için, bu makale fare embriyolarında uzun süreli edinime izin veren iki fotonlu canlı mikroskopi için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Protokole ek olarak, embriyo işleme ve kültür optimizasyonu hakkında ipuçları verilmektedir. Bu, erken fare organogenezindeki önemli olayların anlaşılmasına yardımcı olacak ve kardiyovasküler progenitör biyolojisinin anlaşılmasını artıracaktır.
Introduction
Kalp, embriyogenez sırasında tüm embriyoya besin pompalamaya başlamak için erken oluşurken, gelişmeye devam eder1. Fare embriyolarında, gastrülasyonun başlamasından bir buçuk gün sonra, ön kutup 2,3’te ilkel bir kalp organı toplanır. Erken Çizgi (ES) evresinde, epiblasttaki kardiyak progenitörler ilkel çizgiden yeni ortaya çıkan mezodermal tabaka 4,5,6’ya girer ve ilkel kalp tüpünü oluşturmak için farklılaştıkları ön kutba göç etmeye başlarlar. Bu süreç boyunca, erken kalp progenitörleri, göç7’ye ek olarak hücre yeniden düzenlemelerine, şekil dönüşümlerine ve farklılaşmaya maruz kalırlar (Şekil 1).
Erken kardiyak progenitörler, aynı anda fonksiyonel bir organı ayırt etme ve inşa etme konusundaki olağanüstü yetenekleri nedeniyle yaklaşık bir yüzyıl boyunca araştırmacıları cezbetmiştir. Son yirmi yılda, klonal analiz ve koşullu nakavt modelleri, erken kalp gelişiminin oldukça dinamik bir süreçte farklı hücre kaynaklarını içerdiğini göstermiştir 8,9,10. Bununla birlikte, ilkel kalp tüpünün 3B yapısı ve morfogenezinin dinamik doğası çalışmayı zorlaştırır (Şekil 1) vetam karmaşıklığını anlamaktan çok uzağız.
Bu dinamik hücresel süreçleri incelemek için, canlı görüntüleme yöntemleri şimdi benzeri görülmemiş bir ayrıntı sunuyor 7,12,13,14. Fare modelinde, canlı yaklaşımlar, statik analizile ele alınması zor olan gelişimsel konuları sorgulamanın anahtarı olmuştur 7,13,15. Uzun süreli ex vivo kültür ve sağlam mikroskop kurulumları16,17 hızlı ilerlerken, az sayıda araştırmacı canlı embriyoları başarılı bir şekilde görüntüleme uzmanlığına sahiptir. Kağıt tabanlı yayınlar canlı görüntüleme deneylerini yeniden üretmek için yeterli teknik ayrıntı sağlasa da, bazı beceri ve püf noktalarının görsel örnekler veya eşler arası yardım olmadan kavranması zordur. Bu öğrenme sürecini hızlandırmak ve laboratuvarlar arasında canlı görüntüleme kullanımını yaygınlaştırmak için, gastrulating fare embriyoları üzerinde canlı görüntüleme yapmak için gerekli becerileri toplayan bir video protokolü (Şekil 2) oluşturduk.
Şekil 1: Fare embriyosundaki kardiyak progenitör hücrelerin gastrulasyonun başlangıcından ilkel kalp tüpü oluşumundan önceki aşamaya kadar erken farklılaşması. Kardiyak progenitör hücreler, gastrulasyonun başlamasından kısa bir süre sonra mezoderme girerek embriyonun karşı tarafına göç eder. Diyagramların üzerine morfolojik ve embriyonik gün (E) evresi yazılmıştır. Kesikli oklar, gastrulasyon sırasında ilkel kalp tüpü progenitörlerinin göç yörüngesini tasvir eder. Bu rakam11’den uyarlanmıştır. Kısaltmalar: ES = Early Streak; MS = Orta Çizgi; EHF = Erken Baş Katımı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Erken kalp progenitörlerinin canlı görüntülenmesi için iş akışı diyagramı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Protocol
Representative Results
Discussion
Erken kalp ataları, hala oluşurken atmaya başlayan ilkel bir kalp tüpünde organize olurlar. Bu sürecin nasıl gerçekleştiğini anlamak, konjenital kalp kusurlarının geniş spektrumunu spesifik morfogenetik olaylara belirlemenin anahtarıdır. Bunun için canlı görüntüleme, normal ve kusurlu embriyonik gelişimi artmış zamansal çözünürlükle incelemek için bir fırsat sunar. Bu, özellikle erken kardiyak progenitör hücreleri, çoklu farklılaşma ve göç davranışlarından hızla geçerken incelem…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, bu yöntem üzerindeki önceki çalışmaları için Dr. Kenzo İvanoviç’e ve embriyo montajı konusundaki ilk uzmanlığı sağladığı için Dr. Shigenori Nonaka’nın (Ulusal Doğa Bilimleri Enstitüleri, Japonya) grubuna teşekkür etmektedir. Bu çalışma, İspanya Ministerio de Ciencia e Innovación’dan Grant PGC2018-096486-B-I00 ve AB Horizon 2020 programından MT’ye Grant H2020-MSCA-ITN-2016-722427 ve FEDER Endülüs 2014-2020 Çalışma Programı’ndan JND’ye Hibe 1380918 tarafından desteklenmiştir. MS, La Caixa Vakfı doktora bursu (LCF / BQ / DE18 / 11670014) ve Biyologlar Seyahat Bursu Şirketi (DEVTF181145) tarafından desteklenmiştir. CNIC, İspanya Bilim Bakanlığı ve ProCNIC Vakfı tarafından desteklenmektedir.
Materials
| #55 Forceps | Dumont | 11295-51 | |
| 35 mm Dish with glass coverslip bottom 14 mm Diameter | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| 35 mm vise table | Grandado | SKU 8798771617573 | |
| 50 mL tubes | BD Falcon | 352070 | |
| Distilled water | |||
| DMEM – Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 11966025 | with L-Glutamine, without Glucose, without Na Pyruvate |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10438-026 | |
| Fluorescent reporter transgenic mice (Tg(CBF:H2BVenus,+) | JAX | ||
| Fluorobrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | DMEM for live-cell imaging |
| High-vacuum silicone grease | Dow Corning | Z273554-1EA | |
| Holder for wires | Perlen Pressen | pwb1 | |
| LSM 780 Upright microscope | Zeiss | ||
| MaiTai Deepsee far red pulsed-laser tuned at 980 nm | Spectra-Physics | ||
| Non Descanned Detectors equipped with the filter sets cyan-yellow (BP450-500/BP520-560), green-red (BP500-520/BP570-610) and yellow-red (BP520-560/BP645-710) |
Zeiss | ||
| Obj: 20x water dipping 1.0 NA, long working distance | Zeiss | ||
| P1000 and P200 pipettes | |||
| Paraffin Oil | Nidacon | VNI0049 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | (the final concentration should be 50 μg/mL penicillin and 50 μg/mL streptomycin) |
| Petri dishes 35 mm x 10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| Pipette tips | |||
| Polymethyl methacrylate | Reused from old laboratory equipment | ||
| Rat Serum culture embryo, male rats SPRAGUE DAWLEY RjHan SD | Janvier Labs | 9979 | |
| Set of 160 mm fines | RS PRO | 541-6933 | |
| Standard 1.0 mm glass capillaries | Anima Lab | 1B100F-3 | |
| Sterile 0.22 μm syringe filter | Corning | 431218 | |
| Sterile 5 mL syringe | Fisher Scientific | 15809152 | |
| Tungsten needles | |||
| Ultrasonic homogeniser (sonicator) | Bandelin | BASO_17021 |
Referencias
- Tyser, R. C. V., et al. Calcium handling precedes cardiac differentiation to initiate the first heartbeat. eLife. 5, 17113 (2016).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), 015750 (2014).
- Evans, S. M., Yelon, D., Conlon, F. L., Kirby, M. L. Myocardial lineage development. Circulation Research. 107 (12), 1428-1444 (2010).
- Tam, P. P., Parameswaran, M., Kinder, S. J., Weinberger, R. P. The allocation of epiblast cells to the embryonic heart and other mesodermal lineages: the role of ingression and tissue movement during gastrulation. Development. 124 (9), 1631-1642 (1997).
- Kinder, S. J., Loebel, D. A. F., Tam, P. P. L. Allocation and early differentiation of cardiovascular progenitors in the mouse embryo. Trends in Cardiovascular Medicine. 11 (5), 177-184 (2001).
- Lawson, K. A. Fate mapping the mouse embryo. International Journal of Developmental Biology. 43 (7), 773-775 (1999).
- Ivanovitch, K., Temiño, S., Torres, M. Live imaging of heart tube development in mouse reveals alternating phases of cardiac differentiation and morphogenesis. eLife. 6, 30668 (2017).
- Meilhac, S. M., Buckingham, M. E. The deployment of cell lineages that form the mammalian heart. Nature Reviews Cardiology. 15 (11), 705-724 (2018).
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nature Reviews Genetics. 6 (11), 826-835 (2005).
- Meilhac, S. M., Lescroart, F., Blanpain, C. D., Buckingham, M. E. Cardiac cell lineages that form the heart. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (9), 013888 (2014).
- Sendra, M., Domínguez, J. N., Torres, M., Ocaña, O. H. Dissecting the complexity of early heart progenitor cells. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (1), 5 (2022).
- McDole, K., et al. In toto imaging and reconstruction of post-implantation mouse development at the single-cell level. Cell. 175 (3), 859-876 (2018).
- Saykali, B., et al. Distinct mesoderm migration phenotypes in extra-embryonic and embryonic regions of the early mouse embryo. eLife. 8, 42434 (2019).
- Ichikawa, T., et al. Live imaging of whole mouse embryos during gastrulation: Migration analyses of epiblast and mesodermal cells. PLoS ONE. 8 (7), 64506 (2013).
- Tyser, R. C. V., et al. Single-cell transcriptomic characterization of a gastrulating human embryo. Nature. 600 (7888), 285-289 (2021).
- Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
- Yue, Y., et al. in toto live imaging of cardiomyocyte behaviour during mouse ventricle chamber formation at single-cell resolution. Nature Cell Biology. 22 (3), 332-340 (2020).
- Nowotschin, S., Xenopoulos, P., Schrode, N., Hadjantonakis, A. K. A bright single-cell resolution live imaging reporter of Notch signaling in the mouse. BMC Developmental Biology. 13 (1), 15 (2013).
- Cold Spring Harbor Protocols. Sharpened tungsten needles. Cold Spring Harbor Protocols. , (2012).
- Tam, P. P., Snow, M. H. The in vitro culture of primitive-streak-stage mouse embryos. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 59, 131-143 (1980).
- Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Preparation of rat serum for culturing mouse embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (4), 5593 (2011).
- Tam, P. P. L. Postimplantation mouse development: Whole embryo culture and micro- manipulation. International Journal of Developmental Biology. 42 (7), 895-902 (1998).
- Optimización de propiedades fisicoquímicas y medios de cultivo para el cultivo del embrión de ratón ex vivo. Universidad de Jaén. Biología Experimental Available from: https://hdl.handle.net/10953.1/1400 (2021)
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Vintersen Nagy, K., Nagy, A. . Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual, Fourth Edition. , 814 (2014).
- Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. (2), e160 (2006).
- Nonaka, S. Modification of mouse nodal flow by applying artificial flow. Methods in Cell Biology. 91, 287-297 (2009).
- Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Time-lapse imaging of postimplantation mouse embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (4), 5595 (2011).
- Crainiciuc, G., et al. Behavioural immune landscapes of inflammation. Nature. 601 (7893), 415-421 (2022).
