Détection en temps réel de la production d’espèces réactives de l’oxygène dans la réponse immunitaire dans le riz avec un test de chimiluminescence
Summary
Ici, nous décrivons une méthode pour la détection en temps réel de la production d’espèces réactives apoplastiques de l’oxygène (ROS) dans les tissus de riz dans la réponse immunitaire déclenchée par un modèle moléculaire associé à des agents pathogènes. Cette méthode est simple, standardisée et génère des résultats hautement reproductibles dans des conditions contrôlées.
Abstract
Les espèces réactives de l’oxygène (ROS) jouent un rôle essentiel dans une variété de processus biologiques, y compris la détection des stress abiotiques et biotiques. En cas d’infection pathogène ou de provocation par des produits chimiques associés à des agents pathogènes (profils moléculaires associés aux agents pathogènes [PAMPs]), un éventail de réponses immunitaires, y compris une explosion de ROS, est rapidement induit chez les plantes, ce qui est appelé immunité déclenchée par PAMP (PTI). Un sursaut ROS est une réponse PTI caractéristique, qui est catalysée par un groupe de NADPH oxydases localisées dans la membrane plasmique – les protéines de la famille RBOH. La grande majorité des ROS comprennent du peroxyde d’hydrogène (H2O2), qui peut être facilement et régulièrement détecté par une méthode de chimiluminescence à base de luminol. La chimiluminescence est une réaction produisant des photons dans laquelle le luminol, ou son dérivé (tel que L-012), subit une réaction redox avec ROS sous l’action d’un catalyseur. Cet article décrit une méthode de chimiluminescence optimisée basée sur L-012 pour détecter la production d’apoplast ROS en temps réel lors de l’obtention de PAMP dans les tissus de riz. La méthode est facile, stable, standardisée et hautement reproductible dans des conditions fermement contrôlées.
Introduction
Les espèces réactives de l’oxygène (ROS) comprennent une série de dérivés de l’oxygène chimiquement actifs, y compris les radicaux anioniques superoxydes (O2-) et ses dérivés, les radicaux hydroxyles (OH–), le peroxyde d’hydrogène et les produits de l’oxygène singulet ou des réactions d’oxydoréduction qui sont constamment produits dans les plastes et les chloroplastes, les mitochondries, les peroxysomes et d’autres emplacements subcellulaires1 . Les ROS jouent un rôle important dans de nombreux processus biologiques et sont essentiels pour toutes les plantes 2,3,4. Le large spectre des fonctions ROS varie de la régulation de la croissance et du développement à la perception des stress abiotiques et biotiques 5,6,7,8.
Dans le système immunitaire des plantes, les récepteurs localisés de la membrane plasmique des cellules végétales – appelés récepteurs de reconnaissance de formes (PRR) – perçoivent les profils moléculaires associés aux agents pathogènes (PAMPs) dérivés de produits chimiques dérivés d’agents pathogènes. Cette reconnaissance déclenche une série de réponses immunitaires rapides, y compris l’afflux de calcium, l’éclatement des ROS et la cascade MAPK; ainsi, cette couche d’immunité est appelée immunité déclenchée par la PAMP (PTI). Le sursaut ROS est une réponse PTI caractéristique, dont la détermination est largement appliquée aux études liées à la PTI 9,10. La production de ROS déclenchée par les PAMP est attribuée à la NADPH oxydase résidant dans la membrane plasmique, ou aux protéines homologues de la famille des oxydases respiratoires éclatées (RBOH), qui transfèrent des électrons du NADPH cytosolique ou du NADH à l’oxygène extracellulaire pour produire du superoxyde (O2–) qui est spontanément converti en peroxyde d’hydrogène (H2O2) par la superoxyde dismutase8 . Le rafale ROS déclenchée par PAMP est assez rapide, apparaissant seulement quelques minutes après le traitement PAMP et culminant à ~10-12 min. La grande majorité des molécules ROS comprennent du peroxyde d’hydrogène (H2O2), qui peut être facilement et régulièrement détecté par un test de chimiluminescence.
En chimiluminescence, le réactif de chimiluminescence réagit avec l’oxygène actif, sous l’action d’un catalyseur, pour produire les intermédiaires à l’état excité. Ensuite, les électrons du produit reviennent à l’état fondamental par transition non radiative et émettent des photons. Les réactifs de chimiluminescence courants comprennent le luminol et le L-012, le luminol dominant l’application11,12,13. Cependant, de plus en plus de chercheurs choisissent L-012 pour détecter la production de ROS, car le L-012 a une efficacité d’émission de lumière beaucoup plus élevée dans des conditions de pH neutre ou quasi neutre par rapport au luminol.
Cet article décrit une méthode de chimiluminescence optimisée, basée sur L-012, pour la détection en temps réel de la production de ROS après l’obtention de PAMP dans les tissus et la gaine des tissus du riz (Oryza sativa). La méthode fournie ici est simple, stable et standardisée, et est hautement adaptable pour répondre à différents besoins expérimentaux. Les données obtenues avec cette méthode sont hautement reproductibles dans des conditions fermement contrôlées.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le but de cette étude était d’établir une méthode très efficace pour quantifier la production précoce de ROS en réponse au PAMP dans les tissus du riz. Cette méthode fournit une procédure normalisée pour la détermination en temps réel de l’apoplast ROS produit à partir de tissus de riz traités. Cette méthode est simple à utiliser, peu coûteuse, claire dans sa composition et indépendante des kits commerciaux. Grâce à cette méthode, les chercheurs peuvent étudier la production en temps réel d’a…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions de la Shanghai Natural Science Foundation (numéro de subvention: 21ZR1429300 / BS1500016), de l’Université Jiao Tong de Shanghai (programme Agri-X, numéro de subvention: AF1500088/002), du Shanghai Collaborative Innovation Center of Agri-Seeds (numéro de subvention: ZXWH2150201/001) à Jiangbo Fan et par le projet de collaboration médico-ingénierie de l’Université Jiao Tong de Shanghai (numéro de subvention: 21X010301734) à Can Li.
Materials
| 96-well microtiter plate | WHB | WHB-96-01 | |
| Ethanol absolute | Innochem | A43543 | |
| flg22 | Sangon Biotech | p20973 | PAMP |
| Gen5 | BioTek | software | |
| L-012 | FUJIFILM | 120-04891 | 8-amino-5-chloro-7-phenyl-2,3-dihydropyrido [3,4-d] pyridazine-1,4-dione, CAS #:143556-24-5 |
| Microplate reader | BioTek | Synergy 2 | |
| MS Medium | Solarbio | M8521 | |
| NaCLO | Aladdin | S101636 | |
| Peroxidase from horseradish (HRP) | Sigma | P8375 | |
| Phytagel | Sigma | P8169 | |
| Sampler | Miltex | 15110-40 | |
| Sucrose | Sangon Biotech | A502792 | |
| Tris | Sangon Biotech | A610195 |
Referencias
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