Rilevamento in tempo reale della produzione di specie reattive dell'ossigeno nella risposta immunitaria nel riso con un saggio di chemiluminescenza
Summary
Qui, descriviamo un metodo per la rilevazione in tempo reale della produzione di specie reattive dell’ossigeno apoplastico (ROS) nei tessuti di riso nella risposta immunitaria innescata da pattern molecolari associati ai patogeni. Questo metodo è semplice, standardizzato e genera risultati altamente riproducibili in condizioni controllate.
Abstract
Le specie reattive dell’ossigeno (ROS) svolgono un ruolo vitale in una varietà di processi biologici, tra cui il rilevamento di stress abiotici e biotici. In caso di infezione da patogeni o di sfida con sostanze chimiche associate ai patogeni (modelli molecolari associati ai patogeni [PAMP]), una serie di risposte immunitarie, tra cui un burst di ROS, vengono rapidamente indotte nelle piante, che è chiamata immunità innescata da PAMP (PTI). Un burst ROS è una risposta PTI caratteristica, che è catalizzata da un gruppo di ossidasi NADPH localizzate nella membrana plasmatica, le proteine della famiglia RBOH. La stragrande maggioranza dei ROS comprende perossido di idrogeno (H 2 O2), che può essere facilmente e costantemente rilevato con un metodo di chemiluminescenza a base di luminol. La chemiluminescenza è una reazione che produce fotoni in cui il luminolo, o il suo derivato (come L-012), subisce una reazione redox con ROS sotto l’azione di un catalizzatore. Questo articolo descrive un metodo di chemiluminescenza ottimizzato basato su L-012 per rilevare la produzione di ROS apoplast in tempo reale dopo l’elicitazione di PAMP nei tessuti di riso. Il metodo è facile, costante, standardizzato e altamente riproducibile in condizioni saldamente controllate.
Introduction
Le specie reattive dell’ossigeno (ROS) comprendono una serie di derivati dell’ossigeno chimicamente attivi, compresi i radicali anionici superossido (O2-) e i suoi derivati, i radicali idrossilici (OH-), il perossido di idrogeno e i prodotti dell’ossigeno singoletto o delle reazioni di ossido-riduzione, che sono costantemente prodotti in plastidi e cloroplasti, mitocondri, perossisomi e altre sedi subcellulari1 . I ROS svolgono un ruolo importante in molti processi biologici e sono essenziali per tutte le piante 2,3,4. L’ampio spettro delle funzioni dei ROS varia dalla regolazione della crescita e dello sviluppo alla percezione degli stress abiotici e biotici 5,6,7,8.
Nel sistema immunitario delle piante, i recettori localizzati nella membrana plasmatica delle cellule vegetali – i cosiddetti recettori di riconoscimento dei pattern (PRR) – percepiscono i modelli molecolari associati ai patogeni (PAMP) delle sostanze chimiche derivate dai patogeni. Questo riconoscimento innesca una serie di risposte immunitarie veloci, tra cui afflusso di calcio, ROS burst e cascata MAPK; quindi, questo strato di immunità è chiamato immunità innescata da PAMP (PTI). Il burst ROS è una risposta PTI distintiva, la cui determinazione è ampiamente applicata agli studi relativi a PTI 9,10. La produzione di ROS innescata dai PAMP è attribuita alla NADPH ossidasi residente nella membrana plasmatica, o proteine della famiglia dell’omologo dell’esplosione respiratoria ossidasi (RBOH), che trasferiscono elettroni dal NADPH citosolico o NADH all’ossigeno extracellulare per produrre superossido (O 2–) che viene convertito spontaneamente in perossido di idrogeno (H 2 O 2) dalla superossido dismutasi8 . Lo scoppio di ROS innescato da PAMP è abbastanza rapido, appare solo pochi minuti dopo il trattamento PAMP e raggiunge il picco a ~ 10-12 minuti. La stragrande maggioranza delle molecole di ROS comprende perossido di idrogeno (H 2 O2), che può essere facilmente e costantemente rilevato con un saggio di chemiluminescenza.
Nella chemiluminescenza, il reagente chemiluminescenza reagisce con l’ossigeno attivo, sotto l’azione di un catalizzatore, per produrre gli intermedi di stato eccitato. Quindi, gli elettroni nel prodotto ritornano allo stato fondamentale attraverso la transizione non radiativa ed emettono fotoni. I reagenti comuni a chemiluminescenza includono luminol e L-012, con luminolo che domina l’applicazione11,12,13. Tuttavia, sempre più ricercatori scelgono L-012 per rilevare la produzione di ROS, poiché L-012 ha un’efficienza di emissione luminosa molto più elevata in condizioni di pH neutro o quasi neutro rispetto al luminolo.
Questo articolo descrive un metodo di chemiluminescenza ottimizzato, basato su L-012, per la rilevazione in tempo reale della produzione di ROS dopo l’elicitazione di PAMP nei dischi e nella guaina dei tessuti di riso (Oryza sativa). Il metodo qui fornito è semplice, stabile e standardizzato ed è altamente adattabile per soddisfare diverse esigenze sperimentali. I dati ottenuti con questo metodo sono altamente riproducibili in condizioni saldamente controllate.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lo scopo di questo studio era quello di stabilire un metodo altamente efficiente per quantificare la produzione precoce di ROS in risposta al PAMP nei tessuti di riso. Questo metodo fornisce una procedura standardizzata per la determinazione in tempo reale dei ROS apoplast prodotti da tessuti di riso trattati. Questo metodo è semplice nel funzionamento, a basso costo, chiaro nella composizione e indipendente dai kit commerciali. Utilizzando questo metodo, i ricercatori possono studiare la produzione in tempo reale di RO…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Shanghai Natural Science Foundation (numero di sovvenzione: 21ZR1429300 / BS1500016), Shanghai Jiao Tong University (programma Agri-X, numero di sovvenzione: AF1500088/002), Shanghai Collaborative Innovation Center of Agri-Seeds (numero di sovvenzione: ZXWH2150201 / 001) a Jiangbo Fan, e dal progetto di collaborazione medico-ingegneristica della Shanghai Jiao Tong Univesity (numero di sovvenzione: 21X010301734) a Can Li.
Materials
| 96-well microtiter plate | WHB | WHB-96-01 | |
| Ethanol absolute | Innochem | A43543 | |
| flg22 | Sangon Biotech | p20973 | PAMP |
| Gen5 | BioTek | software | |
| L-012 | FUJIFILM | 120-04891 | 8-amino-5-chloro-7-phenyl-2,3-dihydropyrido [3,4-d] pyridazine-1,4-dione, CAS #:143556-24-5 |
| Microplate reader | BioTek | Synergy 2 | |
| MS Medium | Solarbio | M8521 | |
| NaCLO | Aladdin | S101636 | |
| Peroxidase from horseradish (HRP) | Sigma | P8375 | |
| Phytagel | Sigma | P8169 | |
| Sampler | Miltex | 15110-40 | |
| Sucrose | Sangon Biotech | A502792 | |
| Tris | Sangon Biotech | A610195 |
Referencias
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