Echtzeit-Detektion der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies bei der Immunantwort in Reis mit einem Chemilumineszenz-Assay
Summary
Hier beschreiben wir eine Methode zur Echtzeit-Detektion der Produktion von apoplastischen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in Reisgeweben in einer pathogen-assoziierten molekularmuster-ausgelösten Immunantwort. Diese Methode ist einfach, standardisiert und erzeugt unter kontrollierten Bedingungen hochreproduzierbare Ergebnisse.
Abstract
Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) spielen eine wichtige Rolle in einer Vielzahl von biologischen Prozessen, einschließlich der Wahrnehmung von abiotischen und biotischen Belastungen. Bei einer Infektion mit Krankheitserregern oder einer Herausforderung mit pathogen-assoziierten Chemikalien (Pathogen-assoziierte molekulare Muster [PAMPs]) wird in Pflanzen schnell eine Reihe von Immunantworten, einschließlich eines ROS-Bursts, induziert, was als PAMP-ausgelöste Immunität (PTI) bezeichnet wird. Ein ROS-Burst ist eine charakteristische PTI-Reaktion, die durch eine Gruppe von Plasmamembran-lokalisierten NADPH-Oxidasen – den Proteinen der RBOH-Familie – katalysiert wird. Die überwiegende Mehrheit der ROS besteht aus Wasserstoffperoxid (H2 O2), das durch eine Luminol-basierte Chemilumineszenzmethode leicht und stetig nachgewiesen werden kann. Chemilumineszenz ist eine photonenproduzierende Reaktion, bei der Luminol oder sein Derivat (wie L-012) unter Einwirkung eines Katalysators eine Redoxreaktion mit ROS durchläuft. In diesem Artikel wird eine optimierte L-012-basierte Chemilumineszenzmethode beschrieben, um die Produktion von Apoplast-ROS in Echtzeit bei PAMP-Auslösung in Reisgeweben zu erkennen. Die Methode ist einfach, stabil, standardisiert und unter fest kontrollierten Bedingungen hochgradig reproduzierbar.
Introduction
Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) umfassen eine Reihe von chemisch aktiven Sauerstoffderivaten, einschließlich Superoxidanionenradikalen (O2-) und ihren Derivaten, Hydroxylradikalen (OH–), Wasserstoffperoxid und Produkten von Singulettsauerstoff oder Oxidations-Reduktions-Reaktionen, die ständig in Plastiden und Chloroplasten, Mitochondrien, Peroxisomen und anderen subzellulären Stellen produziert werden1 . ROS spielen eine wichtige Rolle in vielen biologischen Prozessen und sind für alle Pflanzen essentiell 2,3,4. Das breite Spektrum der ROS-Funktionen reicht von der Regulation von Wachstum und Entwicklung bis hin zur Wahrnehmung von abiotischen und biotischen Belastungen 5,6,7,8.
Im pflanzlichen Immunsystem nehmen die Plasmamembran-lokalisierten Rezeptoren der Pflanzenzellen – sogenannte Mustererkennungsrezeptoren (PRRs) – von Krankheitserregern abgeleitete Chemikalien-Erreger-assoziierte molekulare Muster (PAMPs) wahr. Diese Erkennung löst eine Reihe schneller Immunreaktionen aus, darunter Kalziumeinstrom, ROS-Burst und MAPK-Kaskade; Daher wird diese Immunitätsschicht als PAMP-getriggerte Immunität (PTI) bezeichnet. ROS-Burst ist eine charakteristische PTI-Reaktion, deren Bestimmung in PTI-bezogenen Studien weit verbreitet ist 9,10. Die durch PAMPs ausgelöste ROS-Produktion wird auf Plasmamembran-residente NADPH-Oxidase oder Proteine der Respiratory Burst Oxidase Homolog (RBOH)-Familie zurückgeführt, die Elektronen von zytosolischem NADPH oder NADH auf extrazellulären Sauerstoff übertragen, um Superoxid (O 2–) zu produzieren, das durch Superoxiddismutasespontan in Wasserstoffperoxid (H 2 O 2) umgewandelt wird 8 . Der PAMP-getriggerte ROS-Burst ist ziemlich schnell, tritt nur wenige Minuten nach der PAMP-Behandlung auf und erreicht seinen Höhepunkt bei ~10-12 min. Die überwiegende Mehrheit der ROS-Moleküle besteht aus Wasserstoffperoxid (H2 O2), das mit einem Chemilumineszenz-Assay leicht und stabil nachgewiesen werden kann.
Bei der Chemilumineszenz reagiert das Chemilumineszenz-Reagenz unter Einwirkung eines Katalysators mit aktivem Sauerstoff, um die Zwischenprodukte im angeregten Zustand zu erzeugen. Dann kehren die Elektronen im Produkt durch einen strahlungsfreien Übergang in den Grundzustand zurück und emittieren Photonen. Übliche Chemilumineszenz-Reagenzien umfassen Luminol und L-012, wobei Luminol die Anwendung dominiert11,12,13. Immer mehr Forscher entscheiden sich jedoch für L-012, um die ROS-Produktion nachzuweisen, da L-012 im Vergleich zu Luminol eine viel höhere Lichtemissionseffizienz unter neutralen oder nahezu neutralen pH-Bedingungen aufweist.
Diese Arbeit beschreibt eine optimierte Chemilumineszenzmethode, basierend auf L-012, für die Echtzeit-Detektion der ROS-Produktion nach der Induktion von PAMPs in Reisgewebe (Oryza sativa), Blattscheiben und Scheiden. Die hier bereitgestellte Methode ist einfach, stabil und standardisiert und kann in hohem Maße an unterschiedliche experimentelle Anforderungen angepasst werden. Die mit dieser Methode gewonnenen Daten sind unter fest kontrollierten Bedingungen sehr gut reproduzierbar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ziel dieser Studie war es, eine hocheffiziente Methode zur Quantifizierung der frühen ROS-Produktion als Reaktion auf PAMP in Reisgeweben zu etablieren. Diese Methode bietet ein standardisiertes Verfahren zur Echtzeitbestimmung von Apoplasten-ROS, die aus behandeltem Reisgewebe hergestellt werden. Diese Methode ist einfach in der Bedienung, kostengünstig, klar in der Zusammensetzung und unabhängig von kommerziellen Kits. Mit dieser Methode können Forscher die Echtzeitproduktion von Apoplast-ROS untersuchen, wenn Pfla…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Shanghai Natural Science Foundation (Fördernummer: 21ZR1429300/BS1500016), der Shanghai Jiao Tong University (Agri-X-Programm, Fördernummer: AF1500088/002), des Shanghai Collaborative Innovation Center of Agri-Seeds (Fördernummer: ZXWH2150201/001) an Jiangbo Fan und durch das Medical-Engineering Collaboration Project der Shanghai Jiao Tong University (Fördernummer: 21X010301734) an Can Li unterstützt.
Materials
| 96-well microtiter plate | WHB | WHB-96-01 | |
| Ethanol absolute | Innochem | A43543 | |
| flg22 | Sangon Biotech | p20973 | PAMP |
| Gen5 | BioTek | software | |
| L-012 | FUJIFILM | 120-04891 | 8-amino-5-chloro-7-phenyl-2,3-dihydropyrido [3,4-d] pyridazine-1,4-dione, CAS #:143556-24-5 |
| Microplate reader | BioTek | Synergy 2 | |
| MS Medium | Solarbio | M8521 | |
| NaCLO | Aladdin | S101636 | |
| Peroxidase from horseradish (HRP) | Sigma | P8375 | |
| Phytagel | Sigma | P8169 | |
| Sampler | Miltex | 15110-40 | |
| Sucrose | Sangon Biotech | A502792 | |
| Tris | Sangon Biotech | A610195 |
Referencias
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