Здесь мы описываем метод обнаружения в режиме реального времени продукции апопластических активных форм кислорода (АФК) в тканях риса в иммунном ответе, вызванном патогенным молекулярным паттерном. Этот метод прост, стандартизирован и дает высоковоспроизводимые результаты в контролируемых условиях.
Активные формы кислорода (АФК) играют жизненно важную роль в различных биологических процессах, включая обнаружение абиотических и биотических стрессов. При заражении патогеном или контакте с химическими веществами, связанными с патогенами (патоген-ассоциированные молекулярные паттерны [PAMP]), в растениях быстро индуцируется множество иммунных реакций, включая взрыв АФК, что называется иммунитетом, вызванным PAMP (PTI). Всплеск АФК является отличительной реакцией PTI, которая катализируется группой локализованных в плазматической мембране НАДФН-оксидаз – белков семейства RBOH. Подавляющее большинство АФК содержит перекись водорода (H2O2), которая может быть легко и стабильно обнаружена методом хемилюминесценции на основе люминола. Хемилюминесценция представляет собой реакцию, продуцирующую фотоны, в которой люминол или его производное (например, L-012) подвергается окислительно-восстановительной реакции с АФК под действием катализатора. В этой статье описывается оптимизированный метод хемилюминесценции на основе L-012 для обнаружения продукции апопласта АФК в режиме реального времени при выявлении PAMP в тканях риса. Метод прост, устойчив, стандартизирован и легко воспроизводим в строго контролируемых условиях.
Активные формы кислорода (АФК) включают ряд химически активных производных кислорода, включая супероксидные анионные радикалы (O2-) и его производные, гидроксильные радикалы (OH-), перекись водорода и продукты синглетного кислорода или окислительно-восстановительных реакций, которые постоянно образуются в пластидах и хлоропластах, митохондриях, пероксисомах и других субклеточных участках 1 . АФК играют важную роль во многих биологических процессах и необходимы для всех растений 2,3,4. Широкий спектр функций АФК варьируется от регуляции роста и развития до восприятия абиотических и биотических стрессов 5,6,7,8.
В иммунной системе растений рецепторы, локализованные в плазматической мембране растительных клеток – так называемые рецепторы распознавания образов (PRR) – воспринимают химические вещества, полученные из патогенов, – молекулярные паттерны, связанные с патогенами (PAMP). Это распознавание запускает серию быстрых иммунных реакций, включая приток кальция, взрыв АФК и каскад MAPK; таким образом, этот уровень иммунитета называется иммунитетом, вызванным PAMP (PTI). Всплеск АФК является отличительной реакцией PTI, определение которой широко применяется в исследованиях, связанных с PTI 9,10. Продукция АФК, инициируемая PAMP, объясняется резидентной плазматической мембраной белками семейства НАДФН-оксидазы или гомолога респираторной взрывооксидазы (RBOH), которые переносят электроны из цитозольного НАДФН или НАДН во внеклеточный кислород с образованием супероксида (O2–), который спонтанно превращается в перекись водорода (H2O2O2) супероксиддисмутазой8 . Всплеск АФК, вызванный PAMP, довольно быстрый, появляется всего через несколько минут после лечения PAMP и достигает пика через ~ 10-12 минут. Подавляющее большинство молекул АФК содержит перекись водорода (H2O2), которую можно легко и стабильно обнаружить с помощью хемилюминесцентного анализа.
При хемилюминесценции хемилюминесцентный реагент реагирует с активным кислородом под действием катализатора с образованием промежуточных продуктов возбужденного состояния. Затем электроны в продукте возвращаются в основное состояние посредством безызлучательного перехода и испускают фотоны. Общие хемилюминесцентные реагенты включают люминол и L-012, причем люминол доминирует в применении11,12,13. Тем не менее, все больше исследователей выбирают L-012 для обнаружения образования АФК, поскольку L-012 имеет гораздо более высокую эффективность светового излучения в нейтральных или почти нейтральных условиях pH по сравнению с люминолом.
В данной работе описывается оптимизированный метод хемилюминесценции, основанный на L-012, для обнаружения продукции АФК в режиме реального времени после выявления PAMP в тканях риса (Oryza sativa), листовых дисках и оболочке. Представленный здесь метод прост, стабилен и стандартизирован и легко адаптируется к различным экспериментальным потребностям. Данные, полученные с помощью этого метода, обладают высокой воспроизводимостью в строго контролируемых условиях.
Цель этого исследования состояла в том, чтобы создать высокоэффективный метод количественной оценки ранней продукции АФК в ответ на ПАМП в тканях риса. Этот метод обеспечивает стандартизированную процедуру определения в режиме реального времени апопластных АФК, полученных из обрабо?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана грантами Шанхайского фонда естественных наук (номер гранта: 21ZR1429300 / BS1500016), Шанхайского университета Цзяотун (программа Agri-X, номер гранта: AF1500088/002), Шанхайского совместного инновационного центра сельскохозяйственных семян (номер гранта: ZXWH2150201/001) для Цзянбо Фана и Проекта сотрудничества в области медицины и инженерии Шанхайского университета Цзяотун (номер гранта: 21X010301734) для Кан Ли.
96-well microtiter plate | WHB | WHB-96-01 | |
Ethanol absolute | Innochem | A43543 | |
flg22 | Sangon Biotech | p20973 | PAMP |
Gen5 | BioTek | software | |
L-012 | FUJIFILM | 120-04891 | 8-amino-5-chloro-7-phenyl-2,3-dihydropyrido [3,4-d] pyridazine-1,4-dione, CAS #:143556-24-5 |
Microplate reader | BioTek | Synergy 2 | |
MS Medium | Solarbio | M8521 | |
NaCLO | Aladdin | S101636 | |
Peroxidase from horseradish (HRP) | Sigma | P8375 | |
Phytagel | Sigma | P8169 | |
Sampler | Miltex | 15110-40 | |
Sucrose | Sangon Biotech | A502792 | |
Tris | Sangon Biotech | A610195 |