Méthode pour la culture d'embryons de poulet Early ex vivo (Nouvelle Culture)
Summary
Cette vidéo montre la nouvelle culture, une méthode par laquelle les embryons de poulet sont cultivées en dehors de l'œuf jusqu'à 24 heures. Cette méthode permet d'étudier le développement précoce (ligne primitive à 14 soms.), Une période correspondant à E7-9 chez la souris. Les applications de cette technique comprennent l'électroporation, l'hybridation in situ et immunohistochimie.
Abstract
L'embryon de poulet est un outil précieux dans l'étude du développement embryonnaire précoce. Sa transparence, l'accessibilité et la facilité de manipulation, en font un outil idéal pour étudier la formation et la structuration du cerveau, du tube neural, somite et primordia cœur. Applications de la culture d'embryons de poulets comprennent l'électroporation de constructions d'ADN ou d'ARN afin d'analyser la fonction des gènes, des greffes de perles du facteur de croissance revêtement tels que FGF et BMP, ainsi que monter toute l'hybridation in situ et immunohistochimie. Cette vidéo montre les différentes étapes de la culture d'embryon de poulet; d'abord, l'embryon est explanté dans une solution saline. Ensuite, l'embryon est centrée sur un anneau de verre. Les membranes entourant l'embryon sont levées le long des murs de l'anneau. L'anneau est ensuite placé dans une boîte de culture contenant un pool d'albumine. La boîte de culture est scellé et placé dans une chambre humide, où l'embryon est cultivé pendant au moins 24 heures. Enfin, l'embryon est retiré de l'anneau, fixées et traitées pour d'autres applications. Un guide de dépannage est également présentée.
Protocol
Discussion
La méthode de culture New 2 peut être utilisé pour une large variété d'applications, allant de greffes du facteur de croissance contenant des billes 3, de monter toute hybridation de situ et immunohistochimie toute monture 4. Culture sur une période de 24 heures permet la surveillance continue du développement embryonnaire dans des applications comme laps de temps le mouvement des cellules d'analyse 5 ou de surveillance de la GFP contenant des constructions électr…
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la Fondation Margaret M. Alkek au RHF.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Eggs | Animal | Charles River Laboratories | Premium Fertile | |
| Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 or similar | |
| Marsh Automatic Incubator | Tool | Lyon | RX | |
| Hybridization Incubator | Tool | Robbins Scientific | M1000 | |
| Pyrex dish (2) | Tool | |||
| Watchmaker’s glass 50mm | Tool | VWR | 66112-060 | |
| Glass rings | Tool | Physical Plant facility | cut 4 mm thick sections of glass tubing (27 mm outer diam, 25 mm inner diam). Do not fine polish. | |
| Curved Forceps (1) | Surgery | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Forceps (2) | Surgery | Fine Science Tools | 11002-13 | blunt ended using sharpening Stone and 100ul mineral oil |
| Sharpening Stone Dan’s Black Arkansas | Surgery | Electron Microscopy Sciences | 62082-00 | |
| Fine scissors | Surgery | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Plastic dishes | Tool | Falcon | 353001 | |
| Rubber Bulb | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70980 | |
| Pasteur Capillary Pipette | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | round edge under flame |
| Microcapillary tube | Surgery | Sigma | P1049-1PAK | Pull using vertical micropipette puller; blunt end with fine forceps |
| Microdissecting knife | Surgery | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to puncture cavities prior to in situ hybridization |
| Minuten pins 0.2mm diam | Surgery | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Reagent | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
| Diethylpyrocarbonate (depc) | Reagent | Acros Organics | 10025025 | Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave |
Referencias
- Pannett, P. A., Compton, C. A. The cultivation of tissues in saline. Lancet. 206, 381-384 (1924).
- New, D. T. A new technique for the cultivation of the chick embryo in vitro. J. Embryol. Exp. Morph. 3, 326-331 (1955).
- Alvarez, I. S., Araujo, M., Nieto, M. A. Neural induction in whole chick embryo cultures by FGF. Dev. Biol. 199, 42-54 (1998).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen’s node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Fates and migratory routes of primitive streak cells in the chick embryo. Development. 122, 1523-1534 (1996).
- Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nature Protoc. 3, 419-426 (2008).
