Este vídeo demonstra nova cultura, um método pelo qual embriões de galinha são cultivadas fora do ovo por até 24 horas. Este método permite o estudo do desenvolvimento inicial (linha primitiva para 14 som.), Um período correspondente ao E7-9 no mouse. Aplicações desta técnica incluem eletroporação, hibridização in situ e imunohistoquímica.
Abstract
O embrião de galinha é uma ferramenta valiosa no estudo do desenvolvimento embrionário precoce. Sua transparência, acessibilidade e facilidade de manipulação, torná-lo uma ferramenta ideal para estudar a formação e padronização do cérebro, tubo neural somito, e primórdios do coração. Aplicações da cultura de embriões de pintos incluem eletroporação de construções de DNA ou RNA, a fim de analisar a função do gene, os enxertos de contas do fator de crescimento revestido como FGFs e BMPs, bem como montar toda a hibridização in situ e imunohistoquímica. Este vídeo demonstra as diferentes etapas na cultura embrião de galinha; Primeiro, o embrião é explantes em solução salina. Então, o embrião é centrada em um anel de vidro. Membranas que envolvem o embrião são levantadas ao longo das paredes do anel. O anel é então colocada em um prato de cultura contendo um pool de albumina. O prato cultura é lacrado e colocado em uma câmara úmida, onde o embrião é cultivado por até 24 hrs. Finalmente, o embrião é removido do anel, fixadas e processadas para outras aplicações. Um guia resolução de problemas também é apresentada.
Protocol
Parte 1: Banco configurar A câmara úmida é preparado colocando Kimwipe / DDH 2 O na câmara de plástico. Um tubo de Falcon para coletar albumina, pratos para a cultura, anéis, vidro de relógio e eliminação de resíduos são colocados no banco. Pirex é preenchido com solução salina 1,4 l (ver notas [a]). Parte 2: Embrião é explantes em solução salina Os ovos são retirados da incubadora após 16 horas (estágio 4). O ovo …
Discussion
O método de cultura de Nova 2 pode ser usado para uma ampla variedade de aplicações, que vão desde enxertos do fator de crescimento contendo grânulos 3, para montar toda a hibridização in situ e imunohistoquímica montar todo 4. Cultura ao longo de um período de 24 horas permite o acompanhamento contínuo do desenvolvimento embrionário em aplicações como o tempo de análise do movimento lapso célula 5 ou monitoramento de GFP contendo construções electroporated …
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela M. Margaret Alkek Fundação RHF.
Materials
Material Name
Tipo
Company
Catalogue Number
Comment
Eggs
Animal
Charles River Laboratories
Premium Fertile
Stereomicroscope
Microscope
Leica Microsystems
MZ9.5 or similar
Marsh Automatic Incubator
Tool
Lyon
RX
Hybridization Incubator
Tool
Robbins Scientific
M1000
Pyrex dish (2)
Tool
Watchmaker’s glass 50mm
Tool
VWR
66112-060
Glass rings
Tool
Physical Plant facility
cut 4 mm thick sections of glass tubing (27 mm outer diam, 25 mm inner diam). Do not fine polish.
Curved Forceps (1)
Surgery
Electron Microscopy Sciences
72991-4C
Forceps (2)
Surgery
Fine Science Tools
11002-13
blunt ended using sharpening Stone and 100ul mineral oil
Sharpening Stone Dan’s Black Arkansas
Surgery
Electron Microscopy Sciences
62082-00
Fine scissors
Surgery
Fine Science Tools
14161-10
Plastic dishes
Tool
Falcon
353001
Rubber Bulb
Tool
Electron Microscopy Sciences
70980
Pasteur Capillary Pipette
Tool
Electron Microscopy Sciences
70950-12
round edge under flame
Microcapillary tube
Surgery
Sigma
P1049-1PAK
Pull using vertical micropipette puller; blunt end with fine forceps
Microdissecting knife
Surgery
Fine Science Tools
10056-12
Use to puncture cavities prior to in situ hybridization
Minuten pins 0.2mm diam
Surgery
Fine Science Tools
26002-20
Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base
Reagent
Dow Corning
0001986475
Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C