Erken Civciv Embriyolar ex vivo (Kültür) Kültür Yöntemi
Summary
Bu video Yeni kültür, civciv embriyolarının 24 saat kadar yumurta dışında kültür olan bir yöntem gösteriyor. Bu yöntem, erken gelişme (14 som ilkel bir çizgi.) Fare E7-9 karşılık gelen bir süre çalışma sağlar. In situ hibridizasyon ve immünohistokimya, bu tekniğin Uygulamaları elektroporasyon içerir.
Abstract
Civciv embriyo erken embriyonik gelişim çalışmaya değerli bir araçtır. Şeffaflığı, erişilebilirliği ve kolay manipülasyon, bu oluşumu ve beyin, nöral tüp, hücre gruplarının ve kalp primordia desenlendirme eğitimi için ideal bir araçtır. Uygulamaları civciv embriyo kültürü, in situ hibridizasyon ve immünohistokimya, gen fonksiyonu, FGFs ve BMP gibi büyüme faktörü kaplı boncuklar greft yanı sıra tüm montaj analiz etmek için DNA veya RNA yapıları elektroporasyon içerir. Bu video civciv embriyo kültürü farklı adımları gösteriyor; İlk olarak, embriyo tuzlu su eksplante. Sonra, embriyo bir cam yüzük ortalanır. Embriyo çevreleyen zarların halka duvarları boyunca kaldırılır. Bu halka daha sonra, albümin bir havuzun bulunduğu bir kültür tabak içinde yer alır. 24 saat kadar embriyo kültür olduğu kültür çanak, kapalı ve nemli odasında yerleştirilir. Son olarak, embriyo, ring kaldırılır, sabit ve başka uygulamalar için işlenmiş. Bir sorun giderme kılavuzu da sunulmaktadır.
Protocol
Discussion
Yeni kültür yöntemi 2 büyüme faktörü tüm montaj boncuk 3, in situ hibridizasyon ve tüm montaj immünohistokimya 4 içeren greftleri arasında değişen çok çeşitli uygulamalar için de kullanılabilir. 24 saatlik süre içinde Kültür embriyonik gelişim zaman atlamalı hücre hareket analizi 5 veya GFP 6 electroporated yapıları içeren izleme gibi uygulamalar sürekli olarak izlenmesini sağlar.
Acknowledgements
Bu çalışma, Margaret M. RHF Alkek Vakfı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Eggs | Animal | Charles River Laboratories | Premium Fertile | |
| Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 or similar | |
| Marsh Automatic Incubator | Tool | Lyon | RX | |
| Hybridization Incubator | Tool | Robbins Scientific | M1000 | |
| Pyrex dish (2) | Tool | |||
| Watchmaker’s glass 50mm | Tool | VWR | 66112-060 | |
| Glass rings | Tool | Physical Plant facility | cut 4 mm thick sections of glass tubing (27 mm outer diam, 25 mm inner diam). Do not fine polish. | |
| Curved Forceps (1) | Surgery | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Forceps (2) | Surgery | Fine Science Tools | 11002-13 | blunt ended using sharpening Stone and 100ul mineral oil |
| Sharpening Stone Dan’s Black Arkansas | Surgery | Electron Microscopy Sciences | 62082-00 | |
| Fine scissors | Surgery | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Plastic dishes | Tool | Falcon | 353001 | |
| Rubber Bulb | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70980 | |
| Pasteur Capillary Pipette | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | round edge under flame |
| Microcapillary tube | Surgery | Sigma | P1049-1PAK | Pull using vertical micropipette puller; blunt end with fine forceps |
| Microdissecting knife | Surgery | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to puncture cavities prior to in situ hybridization |
| Minuten pins 0.2mm diam | Surgery | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Reagent | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
| Diethylpyrocarbonate (depc) | Reagent | Acros Organics | 10025025 | Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave |
Referencias
- Pannett, P. A., Compton, C. A. The cultivation of tissues in saline. Lancet. 206, 381-384 (1924).
- New, D. T. A new technique for the cultivation of the chick embryo in vitro. J. Embryol. Exp. Morph. 3, 326-331 (1955).
- Alvarez, I. S., Araujo, M., Nieto, M. A. Neural induction in whole chick embryo cultures by FGF. Dev. Biol. 199, 42-54 (1998).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen’s node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Fates and migratory routes of primitive streak cells in the chick embryo. Development. 122, 1523-1534 (1996).
- Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nature Protoc. 3, 419-426 (2008).
