Денатурирующих Мочевина полиакриламидном геле (мочевина PAGE)

Summary

Денатурирующих мочевины полиакриламидном геле используется для разделения одноцепочечных ДНК или РНК, до предела в 500 нуклеотидов. Карбамид в сочетании с тепло денатурации образцов и неструктурированных одной нити мигрировать в гель матрицы в зависимости от их молекулярного веса.

Abstract

СТРАНИЦА мочевины или денатурации мочевиной полиакриламидном геле работают 6-8 М мочевины, которая денатурирует вторичных ДНК или РНК, структурам и используется для их разделения в матрице полиакриламидном геле на основе молекулярной массой. Фрагменты от 2 до 500 баз, с длиной различия как малые, как одного нуклеотида, могут быть разделены с помощью этого метода ^1. Миграция образца зависит от выбранного акриламида концентрации. Высокий процент полиакриламидном решает нижняя молекулярных фрагментов весом. Сочетание мочевины и температуре 45-55 ° С в течение геля позволяет запустить для разделения неструктурированных ДНК или РНК молекул.

В целом этот метод, необходимые для анализа или очистки одноцепочечной ДНК или РНК фрагменты, например, синтезированные или меченых олигонуклеотидов или продуктов из ферментативных реакций расщепления.

В этом видео статье мы покажем, как подготовить и запустить денатурирующих гелях мочевины полиакриламида. Технические чаевые включены в дополнение к оригинальным ^1,2 протокола.

Protocol

Полный и подробный текст протокола для этой экспериментальной процедуры доступны в текущих протоколов в области молекулярной биологии. Подробная шаг за шагом инструкции по сборке гель бутерброд и гель для аппарата можно найти на веб-сайте BioRad ^3.

Необходимое оборудование:
Стеклянные пластины (внутренняя и внешняя)
10 см ячейки: 10,1 х 7,3 см (внутренние пластины), 10,1 х 8,2 см (внешняя пластина), BioRad
20 см ячейки: 20 х 20 см (внутренние пластины), 20 х 22,3 см (внешняя пластина), BioRad
0,5-1,5 мм гребень гель и распорки
Гель литья стенде
Гель аппарат с крышкой и кабели
Высокое напряжение питания
Блок нагрева или водяной бане
Серологические пипетки и помощи пипетки
Пипетки и наконечники
Сушилку гель или сканер

Реагенты и решения:
Карбамид (сверхчистые)
40% полиакриламидном решение (29:1)
10 х КЭ решение (Трис-борат, ЭДТА буфер)
Деионизированная, дистиллированная вода
TEMED
30% (вес / объем) раствор персульфата аммония
0,5 х КЭ решение
Формамид
ЭДТА
Ксилол cyanol
Бромфенол синий
Метанол
Этанол

Объем	50 мл			60 мл			10 мл
Акриламид концентрации	10%	12,5%	15%	10%	12,5%	15%	10%	12,5%	15%
г мочевины	24	24	24	28,8	28,8	28,8	4,8	4,8	4,8
мл 40%-акриловые (29:1)	12,5	15,625	18,75	15	18,75	22,5	2,5	3,125	3,75
ул 30% APS	166	166	166	199,2	199,2	199,2	33	33	33
ул TEMED	20	20	20	24	24	24	4	4	4
10 х TBE	5	5	5	6	6	6	1	1	1
Заполнение объема деионизированной, дистиллированной воды

Таблица 1: Реагенты и решения, необходимые для различных концентраций акриламида и объемов для решения одноцепочечной олигонуклеотидов

Гель сборки сэндвич и геля

1. Соберите геля в соответствии с описанием производителей и закрепить гелем в гель-кастинг камеры ^3. Используйте 0.5-1.5 мм толщиной прокладок.
2. Подготовить соответствующее решение полиакриламида в соответствии с действующими протоколами в области молекулярной биологии или как указано в таблице 1. Для денатурации акриламида гель 20 см х 22 см х 1,5 мм, 60 мл геля решение и для 10,1 х 8,2 см х 1 мм гель 5 мл геля решение является достаточным. Большие гели используются, когда ожидается продукты / полосы в пределах нескольких базах, то больше геля позволит решить полосы с разницей в один нуклеотид. Если ожидается полосы отличаются более чем в 10 нуклеотидов, меньше гели будут пригодны для решения фрагментов. Выберите процент полиакриламид, который соответствует вашим требованиям разделения, более высокие концентрации полиакриламида будет решать более низким молекулярным весом фрагментов. Использование мочевины сверхчистых и смешать с желаемое количество акриламида. Добавить TBE буфер для геля смесь для получения конечной концентрации 0,5-1 х КЭ и заполнить объем деионизированной, дистиллированной воды. Тепло решение в течение 20 секунд в микроволновую печь и смешайте его нежно. Для больших объемов геля повторить этот шаг, пока раствор не рука теплая.
3. Вылейте гель немедленно используя серологические пипетки и автоматические помощи пипетки между двумя стеклянными пластинками. Избегайте введения пузырьков воздуха. Вставьте расческу и пусть гель полимеризуется в течение 30-60 минут.

Настройка аппарата электрофореза и prerun гель

1. Отключите гель из литейной камеры и монтаж его в гель устройства в соответствии с инструкциями производит ^3.
2. Заполните ниже буфера камеры ум работает буфер (0,5-1 х КЭ), что стеклянные пластины будут субобъединены 2-3 см с буфером. Заполните верхнюю палату буфера до верхней части геля проточной буфера.
3. Осторожно снимите расческу и промыть лунки проточной буфера с помощью пипетки и гель загрузкой советы.
4. Прикрепите крышку системы гель и подключить кабели высокого напряжения. Прежде, чем Вы можете загрузить образцы вы должны prerun геля в течение по крайней мере 30 минут в тепло гель и, чтобы удалить остатки мочевины из геля. Оптимальная температура должна быть в пределах 45-55 ° C. Избегайте температур выше 60 ° C в виде полос может мазка или стеклянных пластин может треснуть. Выберите постоянной Вт для prerun (15-25 Вт на гель).

Пробоподготовка

1. В то же время подготовить свои образцы. Таким образом, добавить соответствующее количество 2 х гель загрузкой смеси для вашего образца. Погрузка смесь обычно содержит 90% формамида, 0,5% ЭДТА, 0,1% ксилола cyanol и 0,1% бромфенол синий.
2. Перед образцы могут быть загружены на гель, образцы должны быть тепло денатурированным путем нагревания образцов между 70-90 ° С в течение нескольких минут.

Загрузить и запустить гель

1. Когда prerun закончен, снять крышку и промыть карманы тщательно, как описано выше, как мочевина выщелоченных в скважинах.
2. Применить образцы тщательно со дна кармана. Избегайте введения пузырьков воздуха. Буфер должен быть применен к пустые карманы, чтобы поддерживать равные условия во время запуска.
3. Соберите крышку и запустить гель при постоянном Вт для поддержания гель температуре 55 ° C похожа на prerun. Соблюдайте миграции маркер красители, пока краситель фронт достиг нижней части геля. Запустить продолжительность зависит от процента использовали акриламид, ионной силы буфера и геля толщиной. Запуска может продолжаться от 2-4 часов.
   Проверьте температуру геля. Гель термометра может помочь контролировать правильную температуру во время запуска.

Процесс гель

1. Когда краска фронт подошел к концу гель положить гель из нижнего буфера камеры. Удаление геля из камеры и ослабьте зажимы. Тронуться с места прокладки и тщательно скрывать стеклянных пластин. Если необходимо отрезать верхнюю и геля части.
2. Тщательно передачи гель в блюдо с гелем фиксации решения (той же концентрации КЭ плюс 5-10% метанола и этанола). Оставьте гель в раствор на 5-10 минут и изменение буфера в два раза.
3. Гель готова для дальнейшей обработки использованием вакуумной сушки геля или прямого сканирования геля.

Discussion

1. Группа резкости зависит от нескольких факторов. Объем выборки загружен для резких полос должна быть как можно меньше, то есть идеально между 1-5 мкл. Тем не менее, до 15 мкл может быть загружена который по-прежнему обеспечивает приемлемое разрешение. Менее объем пробы результаты в четкие полосы.
2. Группа качества также зависит от геля толщиной. Растворитель гели, такие как 0,75 мм показывают лучшие результаты, чем толщина 1,5 мм гели.
3. Форма полос может также оказывать влияние при загрузке геля, если образец не в равной степени в гель кармане. В том числе 10% глицерина в загрузки буфера помогает при загрузке геля и образец погружается в так легче.
4. Еще одна потенциальная проблема, которая связана с буфером загрузки образца может произойти, если ожидаемый продукт (ы) работает на том же уровне, одним из загрузки красителей. Кроме того, если флуоресцентные метки используются, некоторые красители показать флуоресцентный сигнал на аналогичной длины волны. Если это так, удаление одного красителя или все красители могут решить эту проблему. Тогда рекомендуется запустить красителя, содержащий примеры в пустой а также размер стандартного.
5. Низкое напряжение на начало выполнения программы также помогает получить четкие полосы, как образец входит гель перед гладко, и он избегает, что коллапс геля карманы из-за высокого напряжения. Короткий низкий процент акриламида концентрирующий гель (4%) может иметь ту же полосу для заточки эффект.
6. Часто встречается проблема гель "улыбается", который из-за неравномерного распределения тепла через геля во время электрофореза. Если гель не окружен буфера, в зависимости котором гель система работает, крепление металлической пластины на стеклянную пластинку поддерживает равномерное распределение тепла и может существенно повысить качество геля.
7. Silanizing стеклянных пластин для увеличения гелей рекомендуется, так как она значительно улучшает обработку гелей после запуска, как гели, как правило, придерживаются стеклянных пластин.

Денатурирующих мочевины полиакриламидном геле (карбамидо-PAGE) полезна для анализа или отдельных одноцепочечных ДНК или РНК фрагменты, а также radionucleotide или люминесцентные меченных образцов.