Lentivirus Productie

Summary

Te maken lentivirussen, zijn DNA-vectoren getransfecteerd in humane 293 cellen. Na de oogst en het concentreren van de supernatant, is virustiter bepaald door fluorescentie expressie met een flowcytometer.

Abstract

RNA-interferentie (RNAi) is een systeem van gene silencing in levende cellen. In RNAi, genen homoloog in volgorde om korte interfererende RNA (siRNA) worden monddood gemaakt bij de post-transcriptionele staat. Short hairpin RNA's, voorlopers van siRNA, kan worden uitgedrukt met behulp van lentivirus, waardoor RNAi in een verscheidenheid van celtypen. Lentivirussen, zoals het Human Immunodeficiency Virus, in staat zijn om infecteren zowel delende als niet-delende cellen. We beschrijven een procedure die tot pakket lentivirussen. Verpakkingen verwijst naar de voorbereiding van de bevoegde virus uit DNA vectoren. Lentivirale vector productie systemen zijn gebaseerd op een 'split' systeem, waar de natuurlijke virale genoom is opgesplitst in afzonderlijke helper plasmide constructen. Deze splitsing van de verschillende virale elementen in vier afzonderlijke vectoren vermindert het risico van een replicatie-capabele virus door toevallige recombinatie van de lentivirale genoom. Hier wordt een vector die de shRNA van rente en drie verpakkingen vectoren (p-VSVG, pRSV, pMDL) tijdelijk getransfecteerd in menselijke 293-cellen. Na ten minste een 48-uur incubatieperiode, is het virus bevat supernatant geoogst en geconcentreerd. Tot slot wordt virustiter bepaald door de verslaggever (TL), expressie met een flowcytometer.

Protocol

Deel 1: Transfectie van HEK 293 cellen te produceren Lentivirussen * 24 uur voor transfectie, plaat 2,5 X 10 6 cellen in een 10 cm schotel voor een confluentie van 50-70% de volgende dag. Begin dit protocol door het opstellen van het DNA waarmee men later transfecteren een de cellen van het virus te maken. De eerste, verdunnen Fugene 6 transfectiereagens Roche, een lipide reagens die deel uitmaken cellen nemen DNA. In een 1,5 ml tube, pipet 30μl Fugene 6 in 600ul serum…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
DMEM HEK 293T cells Penicillin-streptomycin Glutamine Phosphate-buffered saline FBS		Invitrogen
FuGENE 6 transfection reagent pSico mCherry pMDL pRSV pVSVG		Roche
Bleach		Clorox
10-cm cell culture dishes 96 well cell culture dishes		Falcon	353003
Multichannel pipette		Rainin
Filtered pipette tips		Rainin
1.5ml Eppendorf tubes Syringe Syinge filter (0.45-μm)		Eppendorf
Ultracentrifuge tubes		Beckman
Tissue culture incubator at 5% CO2		Coulter
Beckman SW41T.I rotor
Beckman ultracentrifuge		Beckman
Fluorescent microscope		Coulter
FACS Array		Beckman