慢病毒生产

Summary

为了使慢病毒，DNA载体转染到人293细胞。收获后，集中上清液，荧光表达，流式细胞仪，是由病毒滴度。

Abstract

RNA干扰（RNAi）是在活细胞中的基因沉默系统。 RNA干扰，基因同源序列短干扰RNA（siRNA）的沉默转录后的状态。短发夹RNA的siRNA的前体，可使用慢病毒，允许在多种细胞类型中的RNAi表达。慢病毒，如人类免疫缺陷病毒，能够感染分裂和非分裂细胞。我们将描述一个程序包慢病毒。包装是指主管病毒DNA载体的准备。慢病毒载体的生产系统是基于一个“分裂”的制度，其中病毒的天然基因组已分割成单独的辅助质粒结构。这种不同的病毒分子分裂成4个独立的向量，减少不定的慢病毒基因组的重组创造了复制能力的病毒的风险。在这里，一个载体，利息和3个包装载体的shRNA（P – VSVG，PRSV，pMDL）瞬时转染到人293细胞。至少48小时的潜伏期后，病毒上清收获和集中。最后，记者（荧光灯）的表达，流式细胞仪，是由病毒滴度。

Protocol

第1部分：生产慢病毒转染的HEK 293细胞 * 24小时前转，板2.5 × 10 6细胞在50-70％，第二天汇合10厘米菜。 开始准备稍后会转染的细胞，使病毒的DNA与本议定书​​。首先，淡化FuGENE 6转染试剂罗氏公司，脂质体试剂，使细胞组成DNA。在1.5 ml管，移液器30μlFuGENE 6（SFDMEM）为600ul无血清培养基。小心不要让FuGENE触摸管方，因为它是进入中期交付。让这个FuGENE SFDMEM混合?…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
DMEM HEK 293T cells Penicillin-streptomycin Glutamine Phosphate-buffered saline FBS		Invitrogen
FuGENE 6 transfection reagent pSico mCherry pMDL pRSV pVSVG		Roche
Bleach		Clorox
10-cm cell culture dishes 96 well cell culture dishes		Falcon	353003
Multichannel pipette		Rainin
Filtered pipette tips		Rainin
1.5ml Eppendorf tubes Syringe Syinge filter (0.45-μm)		Eppendorf
Ultracentrifuge tubes		Beckman
Tissue culture incubator at 5% CO2		Coulter
Beckman SW41T.I rotor
Beckman ultracentrifuge		Beckman
Fluorescent microscope		Coulter
FACS Array		Beckman