La production de lentivirus

Summary

Pour faire des lentivirus, des vecteurs d'ADN sont transfectés dans les cellules humaines 293. Après la récolte et la concentration du surnageant, le titre viral est déterminé par l'expression de fluorescence avec un cytomètre en flux.

Abstract

L'interférence ARN (ARNi) est un système d'inactivation des gènes dans les cellules vivantes. Dans l'ARNi, les gènes homologues en séquence à court ARN interférents (siRNA) sont réduits au silence à l'état post-transcriptionnel. ARN en épingle à cheveux courts, des précurseurs de siARN, peut être exprimé en utilisant des lentivirus, permettant l'ARNi dans une variété de types cellulaires. Les lentivirus, comme le virus de l'immunodéficience humaine, sont capables d'infecter à la fois la division et non de division des cellules. Nous allons décrire une procédure pour lentivirus colis. Emballage se réfère à la préparation de virus compétents de vecteurs d'ADN. Lentiviraux systèmes de production de vecteurs sont basés sur un «split» du système, où le génome viral naturel a été divisée en des constructions individuelles d'aide plasmide. Ce fractionnement des différents éléments viraux en quatre vecteurs séparés diminue le risque de créer un virus capable de réplication-par recombinaison fortuite du génome lentiviral. Ici, un vecteur contenant le shRNA d'intérêt et de trois vecteurs d'emballage (p-VSVG, pRSV, pMDL) sont transfectées de façon transitoire dans les cellules humaines 293. Après au moins une période d'incubation de 48 heures, le surnageant contenant le virus est récolté et concentrée. Enfin, le titre viral est déterminé par le journaliste (fluorescent) l'expression d'un cytomètre en flux.

Protocol

Partie 1: La transfection de cellules HEK 293 cellules à produire de lentivirus * 24 heures avant la transfection, plaque 2,5 x 10 6 cellules dans un plat de 10cm pour une confluence de 50-70% le jour suivant. Démarrer ce protocole par la préparation de l'ADN avec lequel on sera plus tard son transfecter des cellules de rendre le virus. Premièrement, diluer FuGENE 6 réactif de transfection Roche, un réactif lipidique qui rendent les cellules prennent l'ADN…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
DMEM HEK 293T cells Penicillin-streptomycin Glutamine Phosphate-buffered saline FBS		Invitrogen
FuGENE 6 transfection reagent pSico mCherry pMDL pRSV pVSVG		Roche
Bleach		Clorox
10-cm cell culture dishes 96 well cell culture dishes		Falcon	353003
Multichannel pipette		Rainin
Filtered pipette tips		Rainin
1.5ml Eppendorf tubes Syringe Syinge filter (0.45-μm)		Eppendorf
Ultracentrifuge tubes		Beckman
Tissue culture incubator at 5% CO2		Coulter
Beckman SW41T.I rotor
Beckman ultracentrifuge		Beckman
Fluorescent microscope		Coulter
FACS Array		Beckman