Lentivirus הפקה
Summary
כדי להפוך את lentiviruses, וקטורים DNA הם transfected 293 לתוך תאים אנושיים. לאחר הקציר ריכוז supernatant, titer וירוס נקבעת על ידי ביטוי פלואורסצנציה עם cytometer זרימה.
Abstract
התערבות RNA (RNAi) היא מערכת של להשתקת גנים בתאים חיים. ב RNAi, גנים הומולוגיים ברצף RNAs התערבות קצרות (siRNA) מושתקים במצב שלאחר תעתיק. RNAs מכבנה קצר, מקדימים siRNA, ניתן לבטא באמצעות lentivirus, המאפשר RNAi במגוון רחב של סוגי תאים. Lentiviruses, כגון וירוס הכשל החיסוני האנושי, הם מסוגלים להדביק גם חלוקת ולא חלוקת התאים. נתאר תהליך אשר עד lentiviruses החבילה. אריזות מתייחס הכנת וירוס המוסמכת וקטורים מ-DNA. Lentiviral ייצור מערכות וקטור מבוססים על מערכת "פיצול", כאשר הגנום הנגיפי טבעי כבר התפצלה בונה עוזר אישי פלסמיד. זה פיצול של אלמנטים ויראליים שונים לארבע וקטורים נפרד מפחית את הסיכון של יצירת שכפול נגיף המסוגל ידי רקומבינציה adventitious של הגנום lentiviral. כאן, וקטור המכיל את shRNA עניין ושלושה וקטורים אריזה (p-VSVG, pRSV, pMDL) הם transfected transiently לתוך 293 תאים אנושיים. לאחר תקופה לפחות 48 שעות דגירה, supernatant וירוס המכיל נאסף ומרוכז. לבסוף, titer וירוס נקבעת על ידי הכתב (ניאון) הביטוי cytometer זרימה.
Protocol
Acknowledgements
סנדלר אסטמה בסיסי Research Center (סיף)
קרן סנדלר
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| DMEM HEK 293T cells Penicillin-streptomycin Glutamine Phosphate-buffered saline FBS | Invitrogen | |||
| FuGENE 6 transfection reagent pSico mCherry pMDL pRSV pVSVG | Roche | |||
| Bleach | Clorox | |||
| 10-cm cell culture dishes 96 well cell culture dishes | Falcon | 353003 | ||
| Multichannel pipette | Rainin | |||
| Filtered pipette tips | Rainin | |||
| 1.5ml Eppendorf tubes Syringe Syinge filter (0.45-μm) | Eppendorf | |||
| Ultracentrifuge tubes | Beckman | |||
| Tissue culture incubator at 5% CO2 | Coulter | |||
| Beckman SW41T.I rotor | ||||
| Beckman ultracentrifuge | Beckman | |||
| Fluorescent microscope | Coulter | |||
| FACS Array | Beckman |
References
- Reiser, J. Production and concentration of pseudotyped HIV-1-based gene transfer vectors.. Gene Therapy. , 72-7211 (2000).
- Dull, T., Zufferey, R., Kelly, M., Mandel, R. J., Nguyen, M., Trono, D., Naldini, L. . J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
